Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Summary

Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit omvat

Abstract

Fusaria zijn filamenteuze schimmels in staat om verschillende gifstoffen produceren. Fusarium mycotoxinen, zoals deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric zuur, moniliformin, enz. .. negatieve effecten hebben op zowel mens en dier en sommige worden beschouwd als pathogeniteit factoren. Proteomische studies toonden effectief te zijn voor het ontcijferen van toxine productie mechanismen (Taylor et al., 2008). Alsook voor het identificeren van potentiële pathogene factoren (papier et al.., 2007, Houterman et al., 2007). Fusaria in. Het wordt daarom van fundamenteel belang betrouwbare methoden vast te stellen voor het vergelijken tussen de proteomische studies om te vertrouwen op echte verschillen gevonden in eiwitexpressie tussen de experimenten, stammen en laboratoria. De procedure die zal worden beschreven zou moeten bijdragen tot een grotere mate van standaardisatie van proteomics procedures door twee manieren. De gefilmde protocol wordt gebruikt om het niveau van de details die nauwkeurig kan worden beschreven toenemen. Bovendien is de beschikbaarheid van gestandaardiseerde procedures te verwerken biologische repliceert moet een hogere robuustheid van de gegevens te waarborgen, rekening houdend met de menselijke factor binnen de technische reproduceerbaarheid van de extractie-procedure.

De beschreven protocol vereist 16 dagen voor de voltooiing ervan: veertien dagen voor culturen en twee dagen voor eiwitextractie (figuur 1).

Kortom, zijn Fusarium stammen gekweekt op vaste media voor 4 dagen, ze zijn vervolgens handmatig gefragmenteerd en overgebracht naar een aangepaste toxine inducerende media (Jiao et al., 2008.) Gedurende 10 dagen. Mycelium wordt verzameld door filtratie door een Miracloth laag. Slijpen is uitgevoerd in een koude kamer. Verschillende operatoren uitgevoerd extractie repliceert (n = 3), om rekening te houden met de vertekening als gevolg van technische variaties (figuur 2). Extractie was gebaseerd op een SDS / DTT buffer zoals beschreven in Taylor et al.. (2008) met kleine wijzigingen. Totaal eiwitextractie vereist een neerslag proces van de eiwitten met behulp van aceton / TCA / DTT buffer 's nachts en Aceton / DTT wassen (figuur 3a, 3b). Eiwitten werden uiteindelijk resolubilized in het eiwit-etikettering buffer en gekwantificeerd. De resultaten van de extractie werden gevisualiseerd op een 1D gel (figuur 4, SDS-PAGE), alvorens over te gaan tot 2D-gels (IEF / SDS-PAGE). Dezelfde procedure kan worden toegepast voor proteomics analyses op andere groeiende media en andere filamenteuze schimmels (Miles et al., 2007)..

Protocol

Het protocol vereist dat 16 dagen voor de voltooiing ervan. De termijn is gedetailleerd in figuur 1.

Details voor buffer voorbereiding

• Voorbereiding van de lysis buffer (3 ml per monster).
• Voorbereiding van de was-buffer (50 ml per monster). Deze buffer dient vooraf gekoeld en opgeslagen bij -20 ° C in de diepvries tot verdere analyse en op ijs bewaard gedurende de gehele procedure.
• Voorbereiding van de neerslag buffer (20 ml per monster). Deze buffer dient vooraf gekoeld en opgeslagen bij -20 ° C in de vriezer totdat het nodig is en op ijs bewaard gedurende de gehele procedure.
• Het werk moet bij voorkeur worden uitgevoerd in de koude kamer bij 4 ° C.

Schimmelspecies

Drie stammen gebruikt voor proteomics analyses werden ingedeeld Fusarium graminearum op basis van hun morfologische kenmerken en Vertaling-elongatiefactor Alpha-1 analyse (O'Donnell et al.., 1998)

Deze stammen behoorden tot de CRP-Gabriel Lippmann collectie en werden onderhouden en opgeslagen bij - 80 ° C in 15% glycerol.

Voorbereiding van de mycelia

Schimmels werden gekweekt op V8 gedurende 4 dagen bij 25 ° C afwisselend lichte en donkere periode per 12 uur. Culturen werden gefragmenteerd met behulp van een steriel mes en stukjes van deze culturen werden gebruikt om 250 ml Erlenmeyer kolven met 100 ml van toxine-inducerende media inoculeren. Mycelia werden geoogst na 10 dagen en werden gescheiden van medium door het filteren van de cultuur met een steriele filter. Mycelia werden 3 maal gewassen met steriel water om residuen van het medium en andere verbindingen te verwijderen. Vervolgens hebben we meteen bevroor de cellen door toevoeging van vloeibare stikstof en de monsters bewaard bij -80 ° C.

Algemene beschrijving van het eiwit-extractie

Eiwit monsters werden geëxtraheerd met behulp van de methode beschreven in de figuur 3A en 3B. De Fusarium monsters werden gemalen in vloeibare stikstof en het poeder werd verzameld in 10 ml Teflon buizen. De monsters werden vervolgens geïncubeerd 30 minuten met de lysis buffer, gekookt gedurende 10 minuten, en 2 maal gecentrifugeerd bij kamertemperatuur (12000g gedurende 15 minuten). De supernatanten werden verzameld en geïncubeerd bij -20 ° C met neerslag buffer 's nachts. Na centrifugeren bij 4 ° C 30000g gedurende 45 minuten, de pellets van de neergeslagen eiwitten werden 3 maal gewassen met koude aceton met DTT. Ten slotte is de pellets werden lucht gedroogd en de eiwitten werden resolubilized in de etikettering buffer, het aanpassen van pH op 8. Een sub-steekproef van 30 ml werd verwijderd voor totaal eiwit kwantificering en de overige supernatant werd opgeslagen bij -20 ° C tot eiwit elektroforese.

Figuur 1. Tijdlijn van de procedure.

Figuur 2. Schema voor meerdere operators sample-verwerking.

Figuur 3a.

Figuur 3b. Alstublieft Klik hier om een grotere versie van figuur 3a, of zie hier voor een grotere versie van figuur 3b.

Figuren 3a-b Flow kaarten voor het eiwit extractieprocedure (A: de eerste dag, B: tweede dag)..

Figuur 4. 1D beeld van de proteïne-extracten. Eiwitten werden uitgevoerd tot volledige migratie van blauw tot het einde van de gel die werd gekleurd met lava Purple. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

Discussion

De recente interesse in proteomische benaderingen binnen de schimmel biologie domeinnaam heeft geleid tot een toename van het aantal publicaties met behulp van deze techniek (zoals besproken in Kim et al., 2007).. Methoden voor eiwitextractie rekenen op een combinatie van extractie procedures, ze zijn vaak nauwelijks beschreven in de methodologische secties en vereisen expertise in het omgaan met de mogelijke methoden voor probleemoplossing.

Net als voor andere "omics"-benaderingen, het vaststellen van normen voor het monster en verwerking van gegevens is essentieel om betrouwbare wetenschappelijke informatie te genereren. Bovendien monsters en procedures van manipulatie moeten adequaat worden omschreven, teneinde een gemeenschappelijk resultaat interpretatie tussen de verschillende "omics" experimenten toe te staan. Dit zou essentieel zijn voor het volledig benutten van potentieel van cross-data mining in genomics, proteomics, metabolomics, ... (Morrison et al., 2006).. Minimale informatie over een proteomics experiment is opgesteld en de werkgroepen zijn ingesteld om alle aspecten van een experiment (gel electroforese, massaspectrometrie, moleculaire interacties, eiwitmodificaties, Proteomics Informatica, Sample Processing) aan te pakken. Op dit moment geen gebruik van informatie zijn beschikbaar op monster verwerking procedures. Gezien het belang van eiwit-extractie procedures in het bepalen van de uiteindelijke kwaliteit van proteoomanalyse studies, om procedures die standaardisatie kan verhogen in het kader van MIAPE richtlijnen (Taylor et al., 2007). Implementeren, hebben we voorgesteld het gebruik van een video-protocol waarin monster verwerking. Video beschrijving van de experimenten kunnen aanzienlijk bijdragen tot het aantal van informatie over de verwerking van monsters die kunnen leiden tot een betere reproduceerbaarheid van "omics" experimenten (Pasquali, 2007) te verhogen.

Inderdaad, reproduceerbaarheid over laboratoria is een fundamentele vereiste om de validiteit te waarborgen van proteomics resultaten (http://www.fixingproteomics.org). De cross-laboratorium reproduceerbaarheid wordt beïnvloed door twee factoren: verschillende bezettingen en verschillende operators manipuleren van monsters.

In de beschreven protocol, stellen we voor om te presteren biologische repliceert met meerdere operatoren (figuur 2 en video) naar de betrouwbaarheid van de gegevens (dat wil zeggen technische variant van de resultaten wordt rekening gehouden) te verhogen.

De procedure beschreven voor eiwit-extractie is gebaseerd op de SDS en verwarming. Dit werd eerder aangetoond dat een goede zuiverheid en hoeveelheid van eiwitten (Bridge 1996) te garanderen. SDS in combinatie met kokend lost celwanden, hydrofobe eiwitten en voorkomt de vorming van oligomeren die afbreken neerslag van eiwitten. Koken maakt het ook mogelijk inactivatie van proteasen. Hetzelfde effect wordt ook geproduceerd door EDTA, PMSF en complete mini-protease-remmer. DTT verwijdert disulfide bruggen in en tussen eiwitten faciliteren eiwit oplosbaar.

Om de SDS te verwijderen voordat IEF, zijn eiwitten neergeslagen door aceton / TCA / DTT. Bovendien, aceton / TCA / DTT neerslag kan het verwijderen van bepaalde verontreinigingen, zoals lipiden, nucleïnezuren, zouten en / of fenolische verbindingen wanneer deze verbindingen aanwezig zijn. Net als SDS, deze moleculen voorkomen dat een goede migratie tijdens het IEF. Na deze neerslag, is het noodzakelijk om de neergeslagen eiwitten wassen aceton / DTT, om TCA te verwijderen als het kan interfereren met IEF.

Een goed voorbeeld voorbereiding is de sleutel tot goede resultaten. Voor deze, is het ook essentieel om te voorkomen dat verontreiniging van eiwitten uit de omgeving het werken met poeder handschoenen en het respecteren van goede laboratoriumpraktijken. Vanuit een technisch oogpunt, binnen het beschreven protocol, de meest kritische stappen voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden en de zuiverheid van eiwitten zijn twee fasen. Eerste, het slijpen fase waarin volledige vernietiging van de cel is fundamenteel voor eiwitten vrijkomen, en ten tweede, de zuivering van totale eiwitten, een fase omvat het verwijderen van de meerderheid van de lipiden, DNA en andere verontreinigingen die kunnen interfereren met de migratie van eiwitten.

Materials

Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. V8 agar: 200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer: 100mL Final concentration Tris-HCL pH8 5mL 50mM 1M SDS 2g or 10mL 2% 20% DTT 500mL 10mM 2M EDTA 20mL 0.1mM 0.5M PMSF 200mL Complete mini protease inhibitor 1 tablet Water Qsp Precipitation Buffer: 100mL Final concentration TCA 20mL 20% DTT 0.1mL 0.1% Aceton Qsp Washing Buffer: 100mL Final concentration DTT 0.1mL 0.1% Aceton 100mL Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots): 1mL Final concentration Urea 140 mg 7M Thiourea 50 mg 2M CHAPS 40 mg 4% Tris 30 μL 30 mM Water 1 mL