Summary
Extraction de protéines pour les analyses protéomiques espèces fongiques nécessite un niveau élevé de standardisation d'être accomplie selon le minimum d'informations sur une expérience de protéomique (MIAPE) des lignes directrices. Nous vous présentons une vidéo-protocole qui comprend une procédure pour minimiser les biais expérimentaux lors de l'induction de toxines et d'extraction de protéines à partir
Abstract
Fusarium sont des champignons filamenteux capables de produire différentes toxines. Mycotoxines de Fusarium telles que le déoxynivalénol, le nivalénol, T2, zearelenone, fusarique acide, moniliformine, etc .. avoir des effets néfastes sur la santé humaine et animale et certains sont considérés comme des facteurs de pathogénicité. Des études protéomiques ont montré pour être efficace pour déchiffrer les mécanismes de production de toxines (Taylor et al., 2008) ainsi que pour identifier les facteurs pathogènes potentiels (papier et al., 2007, Houterman et al., 2007) dans Fusarium. Il devient donc essentiel d'établir des méthodes fiables permettant de comparer entre les études protéomiques afin de s'appuyer sur des différences réelles dans l'expression de protéines parmi les expériences, les souches et les laboratoires. La procédure qui sera décrite devrait contribuer à une augmentation du niveau de la standardisation des procédures de protéomique de deux manières. Le protocole a filmé est utilisé pour augmenter le niveau de détails qui peuvent être décrits avec précision. Par ailleurs, la disponibilité de procédures normalisées pour traiter biologiques répétitions doit garantir une plus grande robustesse des données, en tenant également compte du facteur humain au sein de la reproductibilité technique de la procédure d'extraction.
Le protocole décrit nécessite 16 jours pour sa réalisation: quatorze jours pour les cultures et deux jours pour l'extraction des protéines (figure 1).
Brièvement, les souches de Fusarium sont cultivés sur des milieux solides pour quatre jours, ils sont ensuite manuellement fragmentée et transférée dans un média induisant modifiés toxine (Jiao et al, 2008.) Pendant 10 jours. Le mycélium est recueilli par filtration à travers une couche Miracloth. Le broyage est effectué dans une chambre froide. Différents opérateurs ont effectué l'extraction répétitions (n = 3) afin de prendre en compte les biais dus aux variations techniques (figure 2). L'extraction a été basée sur un tampon SDS / DTT comme décrit dans Taylor et al. (2008) avec de légères modifications. L'extraction des protéines totales nécessaires un procédé de précipitation des protéines à l'aide Acétone / TCA / TNT tampon de lavage de nuit et d'acétone / TNT (figure 3a, 3b). Les protéines ont finalement été remis en solution dans le tampon de la protéine-étiquetage et quantifiés. Résultats de l'extraction ont été visualisées sur un gel 1D (Figure 4, SDS-PAGE), avant de procéder à des gels 2D (IEF / SDS-PAGE). La même procédure peut être appliquée pour les analyses protéomiques sur d'autres supports de culture et d'autres champignons filamenteux (Miles et al., 2007).
Protocol
Le protocole exige 16 jours pour son achèvement. Le calendrier est détaillé dans la figure 1.
Détails pour la préparation des tampons
- Préparation du tampon de lyse (3 ml par échantillon).
- Préparation du tampon de lavage (50 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu'à ce que d'autres analyses et conservés sur la glace pendant toute la procédure.
- Préparation du tampon de précipitation (20 ml par échantillon). Ce tampon doit être pré-refroidis et conservés à -20 ° C dans le congélateur jusqu'à ce que nécessaire et conservé sur la glace durant toute la procédure.
- Les travaux devraient préférentiellement être réalisée dans la chambre froide à 4 ° C.
Espèces de champignons
Trois souches utilisées pour les analyses protéomiques ont été classés à Fusarium graminearum sur la base de leurs caractéristiques morphologiques et Alpha-1-facteur d'élongation de la traduction d'analyse (O'Donnell et al., 1998)
Ces souches appartiennent à la collection du CRP-Gabriel Lippmann et ont été maintenus et conservés à - 80 ° C dans 15% de glycérol.
Préparation du mycélium
Les champignons ont été cultivés sur V8 de 4 jours à 25 ° C alternant période de lumière et l'obscurité à chaque 12 heures. Les cultures ont été fragmentés en utilisant une lame stérile et des morceaux de ces cultures ont été utilisés pour inoculer 250 ml erlenmeyers contenant 100 ml de toxine induisant des médias. Mycéliums ont été récoltés après 10 jours et ont été séparés de moyenne en filtrant la culture avec un filtre stérile. Mycéliums ont été lavés 3 fois avec de l'eau stérile pour enlever les résidus moyennes et d'autres composés. Nous avons alors immédiatement gelé les cellules en ajoutant l'azote liquide et conservés les échantillons à -80 ° C.
Description générale de l'extraction des protéines
Les échantillons de protéines ont été extraites selon la méthode décrite dans la figure 3A et 3B. Les échantillons de Fusarium ont été broyés dans l'azote liquide et la poudre a été recueilli dans des tubes en téflon 10 ml. Les échantillons ont ensuite été incubées 30 minutes avec le tampon de lyse, bouillis pendant 10 minutes, puis centrifugé 2 fois à température ambiante (12000g pendant 15 minutes). Les surnageants ont été recueillis et mis en incubation à -20 ° C avec un tampon de précipitations durant la nuit. Après centrifugation à 4 ° C pendant 45 minutes Acheter 30000G, les boulettes de protéines précipitées ont été lavés 3 fois avec de l'acétone froide contenant du DTT. Enfin, les granulés sont séchés à l'air et les protéines ont été remis en solution dans le tampon d'étiquetage, ajuster le pH à 8. Un sous-échantillon de 30 ml a été retiré pour la quantification des protéines totales et le surnageant restant a été stocké à -20 ° C jusqu'à ce que l'électrophorèse des protéines.
Figure 1. Chronologie de la procédure.
Figure 2. Schéma de plusieurs opérateurs de l'échantillon de traitement.
Figure 3a.
Figure 3b.
Figures 3a-b diagrammes de flux pour la procédure d'extraction de protéines (A: premier jour; B: deuxième jour)..
Figure 4. Image 1D d'extraits protéiques. Les protéines ont été déroulera jusqu'au migration complète de bleu à la fin du gel qui a été coloré avec du violet de lave.
Discussion
L'intérêt récent pour les approches protéomiques dans le domaine de la biologie des champignons a conduit à une augmentation du nombre de publications utilisant cette technique (tel que revu à Kim et al., 2007). Méthodes pour l'extraction des protéines reposent sur une combinaison des méthodes d'extraction, ils sont souvent à peine décrits dans les sections méthodologiques et nécessitent une expertise dans le traitement des méthodes de dépannage potentiel.
Comme pour les autres «omiques» les approches, l'établissement de normes pour le traitement des échantillons et des données est essentielle afin de générer des renseignements scientifiques fiables. Par ailleurs des échantillons et des procédures de manipulation doivent être convenablement décrite afin de permettre l'interprétation des résultats partagés entre les différents «omiques» expériences. Ce serait essentielle pour exploiter pleinement potentialité de la Croix-de data mining en génomique, protéomique, métabolomique, ... (Morrison et al., 2006). Minimum d'informations sur une expérience de protéomique a été rédigé et groupes de travail ont été établis afin d'aborder tous les aspects d'une expérience (électrophorèse sur gel, la spectrométrie de masse, les interactions moléculaires, modifications des protéines, de l'informatique de la protéomique, de traitement des échantillons). Pour l'instant aucune information définis sont disponibles sur les procédures de traitement des échantillons. Compte tenu de l'importance des procédures d'extraction de protéines dans la détermination de la qualité finale des études de protéomique, afin de mettre en œuvre des procédures qui peuvent accroître la normalisation dans le cadre de directives MIAPE (Taylor et al., 2007), nous avons proposé l'utilisation d'un protocole vidéo détaillant l'échantillon de traitement. Video description d'expériences peut contribuer sensiblement à augmenter le nombre d'informations sur le traitement des échantillons qui peuvent conduire à une meilleure reproductibilité des «omiques» des expériences (Pasquali, 2007).
En effet, la reproductibilité entre les laboratoires est une exigence fondamentale pour garantir la validité des résultats en protéomique (http://www.fixingproteomics.org). La reproductibilité inter-laboratoire est influencé par deux facteurs: des instrumentations différentes et les différents opérateurs manipulant des échantillons.
Dans le protocole décrit, nous proposons d'effectuer biologiques reproduit impliquant plusieurs opérateurs (figure 2 et vidéo) pour augmenter la fiabilité des données (c.-à la variation des résultats techniques est prise en compte).
La procédure décrite pour l'extraction des protéines est basé sur la SDD et le chauffage. Cela a été montré précédemment pour garantir une bonne pureté et la quantité de protéines (Pont, 1996). SDS couplée à bouillante en dissout les parois des cellules, des protéines hydrophobes et empêche la formation d'oligomères que les précipitations abort des protéines. D'ébullition permet également l'inactivation de protéases. Le même effet est produit aussi par l'EDTA, PMSF et complète inhibiteur de la protéase mini. TNT supprime des ponts disulfure dans et entre les protéines facilitant la solubilisation des protéines.
Afin de supprimer les FDS avant d'IEF, les protéines sont précipitées par l'acétone / TCA / TNT. Par ailleurs, l'acétone / TCA / TNT précipitations permet d'enlever certains contaminants comme les lipides, les acides nucléiques, de sels et / ou composés phénoliques lorsque ces composés sont présents. Comme SDS, ces molécules empêchent une bonne migration lors de l'IEF. Suite à cette précipitation, il est nécessaire de laver les protéines précipitées par l'acétone / TNT, afin d'éliminer le TCA que cela peut interférer avec l'IEF.
Une préparation de l'échantillon bonne est la clé de bons résultats. Pour cela, il est également essentiel d'éviter la contamination des protéines à partir de l'environnement de travail avec des gants sans poudre et le respect de bonnes pratiques de laboratoire. D'un point de vue technique, dans le protocole décrit les étapes les plus critiques pour obtenir des quantités suffisantes et la pureté des protéines sont deux phases. Tout d'abord, la phase de broyage où la destruction complète de la cellule est fondamentale pour la libération de protéines et, deuxièmement, la purification de protéines totales, une phase qui englobe la suppression de la majorité des lipides, ADN et d'autres contaminants qui peuvent interférer avec la migration des protéines.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Servane Contal et Boris Untereiner pour leur contribution technique. Nous reconnaissons l'appui du FNR "FUTOX" du projet.
Materials
Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer:
Precipitation Buffer:
Washing Buffer:
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
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References
- Bridge, P. Protein Extraction from Fungi. Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).
- Jiao, F. Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture. FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).
- Kim, Y. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).
- Milles, J. Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds. Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).
- Morrison, N., Field, D. Concept of sample in OMICS technology. OMICS. 10, 127-137 (2006).
- O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. PNAS. 95, 2044-2049 (1998).
- Paper, J. M. Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum. Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).
- Pasquali, M. Video in science. Protocol videos: the implications for research and society. EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).
- Taylor, C. F. The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).
- Taylor, R. D. Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions. Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).
