Summary
곰팡이 종의 proteomic 분석을위한 단백질 추출 proteomic 실험 (MIAPE) 지침에 대한 최소한의 정보에 따라 달성하는 표준화의 높은 수준이 필요합니다. 우리는에서 독소 유도와 단백질 추출하는 동안 실험 바이어스를 최소화하는 절차를 포함하는 비디오 프로토콜을 제시
Abstract
Fusaria 다른 독소를 생산할 수 filamentous 곰팡이 있습니다. 이러한 deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric 산, moniliformin 등 Fusarium의 mycotoxins .. 인간과 동물 모두 건강에 악영향을하고 일부는 pathogenicity 요인으로 간주됩니다. Proteomic 연구 Fusaria 잠재적인 병원성 요인 (종이 외., 2007, Houterman 외., 2007) 식별을위한 독소 생산 메커니즘 (테일러 외., 2008)뿐만 아니라 해독 효과로했다. 그것은 실험, 종자 및 연구소 간의 단백질 발현에있는 진실의 차이에 의존하기 위해 proteomic 연구 간의 비교에 대한 신뢰할 수있는 방법을 확립하는 것이 기본이된다. 설명되는 절차는 두 가지 방법에 의해 proteomic 절차의 표준화 수준 증가에 기여한다. 촬영 프로토콜은 정확하게 표현할 수있는 세부 수준을 향상하는 데 사용됩니다. 또한, 생물 학적 처리 표준 절차의 가용성 추출 절차의 기술 재현성 내에서 또한 계정에 인간의 요소를 복용 데이터의 높은 견고을 보장해야 복제합니다.
문화와 단백질 추출 (그림 1)의 두 가지 일 십사일 : 설명 프로토콜은 완성 16 일 필요합니다.
간단히, Fusarium의 종자는 4 일 동안 고체 매체에 재배되며 그들은 다음 수동 조각과 10 일 동안 수정된 독소의 유도 매체 (Jiao 외, 2008.)으로 전송됩니다. 균사체는 Miracloth 계층을 통해 여과에 의해 수집됩니다. 연마는 감기 챔버에서 수행됩니다. 추출을 수행 다른 연산자는 계정으로 기술 변화 (그림 2)로 인해 편견을하기 위해 (N = 3)를 복제합니다. 추출로 테일러 외에 설명된 SDS / DTT 버퍼를 기반으로했다. (2008) 약간 수정. 총 단백질 추출 Aceton / TCA / DTT 버퍼 야간 및 DTT / 아세톤 세척 (그림 3A, 3B)를 사용하여 단백질의 침전 과정을 필요합니다. 단백질은 결국 단백질 분류 버퍼 resolubilized 및 계량했다. 추출 결과는 2D 젤 (IEF / SDS - PAGE)로 진행하기 전에, 1D 젤 (그림 4, SDS - PAGE)에 시각되었습니다. 동일한 절차는 다른 성장 미디어 및 기타 filamentous 곰팡이 (마일즈 외., 2007)에서 proteomic 분석에 대해 적용할 수 있습니다.
Protocol
프로토콜은 완성 16 일 필요합니다. 기간은 그림 1에 자세히 있습니다.
버퍼 준비 세부
- 용해 완충액 (샘플 당 3mL)를 준비.
- 세탁 버퍼 (샘플 당 50mL)의 준비. 이 버퍼는 미리 냉장 및 저장 -20 ° C에서 냉동실에 대한 분석까지 전체 절차를 수행하는 동안 얼음에 보관해야합니다.
- 강수량 버퍼 (샘플 당 20mL)의 준비. 전체 절차를 수행하는 동안 필요한 얼음에 보관 때까지 버퍼는 냉동실에 -20 ° C에서 사전 냉장 및 저장해야합니다.
- 작품은 우선적으로 4 추위 챔버로 진행되어야 ° C.
곰팡이 종
proteomic 분석에 사용되는 세 가지 변종들은 형태학의 기능과 번역 - 연신율 팩터 알파 - 1 분석을 바탕으로 Fusarium의 graminearum로 분류되었다 (오도넬 외., 1998)
이 변종은 CRP - 가브리엘 Lippmann 컬렉션에 속한 유지와에 저장된 - 80 ° C 15 %의 글리세롤.
mycelia의 준비
곰팡이는 25 ° C 빛과 어둠의 기간을 번갈아 가며 각 12 시간에서 4 일간 V8에서 재배되었다. 문화는 살균 칼날과 이러한 문화의 조각 독소 - 유도 미디어 100 ML를 포함 250 ML Erlenmeyer flasks의를 예방하는 데 사용되었다를 사용하여 조각난되었습니다. Mycelia 10 일 후에 수확되었고 살균 필터와 문화를 필터링하여 중간에서 분리되었다. Mycelia는 중간 잔류물 및 기타 화합물을 제거하는 살균 물을 3 번 씻어했다. 그러면 즉시 액체 질소를 추가하여 세포를 동결하고 -80에서 샘플을 보관 ° C.
단백질 추출에 대한 일반적인 설명
단백질 샘플은 그림 3A와 3B에서 설명한 방법을 사용하여 추출되었다. Fusarium 샘플은 액화 질소에 지상되었고 분말 10 ML 테플론 튜브에 수집되었다. 샘플은 다음, 용해 버퍼로 30 분 incubated 10 분 끓인하고, 실온 (15 분 1만2천그램)에 2 번 centrifuged했다. supernatants는 하루 강수량 버퍼와 -20 ° C에서 수집된와 incubated했다. 4 원심 분리 후 ° C 3만그램 45 분 간은 시켰던 단백질의 알약이 DTT를 포함하는 차가운 아세톤과 함께 3 번 씻어했다. 마지막으로, 알약은 공기 건조되었으며 단백질은 8 산도 조정, 라벨 버퍼에 resolubilized되었습니다. 30 ML의 하위 샘플은 총 단백질 양을 정함 위해 제거된 나머지 뜨는은 단백질 전기 영동까지 -20 ° C에서 보관되었다.
그림 1. 절차의 타임 라인.
그림 2. 여러 연산자 샘플 처리를위한 제도.
그림 3A. 
그림 3B는하시기 바랍니다. 여기를 클릭하십시오 더 큰 그림 3A 버전, 또는 볼 수 는 여기에 그림 3B의 더 큰 버전을 위해.
그림 3A - B 단백질 추출 절차 흐름 차트 (A : 첫날, B : 두번째 날)..
그림 4. 단백질 추출물 1D 그림. 단백질은 용암 퍼플 물들일 있던 젤의 끝에 파란색 완벽하게 마이 그 레이션까지 실행했다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Discussion
곰팡이 생물 도메인 내에서 proteomic 접근법에 최근 관심이 기술을합니다 (김 외., 2007 년 검토)를 사용하는 출판물의 증가 수를되었다. 단백질 추출을위한 방법은 추출 절차의 조합에 의존하고, 그들은 종종 기뻐서 방법론 섹션에서 설명하지 않고 잠재적인 문제 해결 방법을 다루는의 전문 지식을 요구하고 있습니다.
샘플 및 데이터 처리를위한 표준을 설정 기타 "omics"접근에 대해서는 것은 신뢰할 수있는 과학적 정보를 생성하기 위해서는 필수적입니다. 또한 샘플 및 조작의 절차가 적절하게 다른 "omics"실험간에 공유 결과 해석을 수 있도록 설명해야합니다. 이것은 완전히 게놈, proteomics, metabolomics에 간 데이터 마이닝의 잠재력을 활용을 위해 필수적인 것입니다 ... (모리슨 외., 2006). 실험의 모든 측면 (겔 전기 영동, 질량 분광법, 분자 상호 작용, 단백질 수정, Proteomics의 정보학, 샘플 처리)에 대처하기 위해서는 proteomic 실험에 대한 최소 정보는 초안되었으며 작업 그룹이 설립되었습니다. 현재에는 정의된 정보는 샘플 처리 절차에 사용할 수 없습니다. (테일러 외., 2007) MIAPE 지침의 골격 내에서 표준화를 높일 수 있습니다 절차를 구현하기 위해, proteomic 연구의 최종 품질을 결정하는 단백질 추출 절차의 중요성을 감안할 때, 우리는 샘플을 상세하게 비디오 프로토콜의 사용을 제안 처리. 실험의 비디오 설명은 "omics"실험 (Pasquali, 2007)보다 재현성을 초래할 수 샘플 처리에 대한 정보의 수를 늘리기 위해 크게 기여할 수 있습니다.
사실, 실험실에 걸쳐 재현성은 proteomics 결과 (http://www.fixingproteomics.org)의 유효성을 보장하기 위해 기본적인 요구 사항입니다. 다른 instrumentations과 다른 연산자 샘플을 조작 : 크로스 실험실 재현성은 두 요인에 의해 영향을받습니다.
설명 프로토콜에서, 우리는 수행하기 위해 제안 생물 학적 데이터 (즉, 결과의 기술 변화가 고려됩니다)의 신뢰성을 높이기 위해 여러 개의 연산자 (그림 2 및 비디오)를 포함하는 복제합니다.
단백질 추출에 대해 설명한 절차는 SDS와 난방을 기반으로합니다. 이것은 이전에 단백질의 좋은 순도와 수량 (브리지 1996) 보장하는 표시했다. SDS는 세포 벽, 소수성 단백질을 해체하고 oligomers 형성 단백질의 중단 석출을 방지 끓고와 결합. 비등은 프로 테아제의 불활 성화도 있습니다. 같은 효과는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), PMSF하고 완전한 미니 테아제 억제제에 의해도 생산합니다. DTT는과 단백질 solubilization을 촉진 단백질 사이의 이황화 다리를 제거합니다.
IEF 전에 SDS를 제거하기 위해 단백질은 아세톤 / TCA / DTT에 의해 시켰던 있습니다. 또한, 아세톤 / TCA / DTT 강수량이 화합물이 존재할 때 이러한 lipids, 핵산, 염분 또는 / 및 페놀 수지 carbon 화합물 같은 오염 물질을 제거하실 수 있습니다. SDS와 마찬가지로,이 분자는 IEF 동안 좋은 마이 그 레이션되지 않습니다. 이 강수량에 따라, 그것이 IEF를 방해할 수있는 TCA를 제거하기 위해 아세톤 / DTT에 의해 시켰던 단백질을 씻어 필요합니다.
좋은 샘플 준비는 좋은 결과의 핵심입니다. 이를 위해, 분말 무료 장갑 작업과 좋은 실험실 관행을 존중 환경에서 단백질의 오염을 방지하는 것도 중요 그것이다. 보기의 기술적 관점에서 설명하는 프로토콜 내에서 단백질의 충분한 양을과 정결을 얻기위한 가장 중요한 단계는 두 단계입니다. 먼저, 연삭 세포의 완전한 파괴는 단백질을 공개하는 근본이다 단계, 둘째, 총 단백질의 정화, lipids, DNA와 단백질의 마이 그 레이션을 방해할 수있는 다른 오염 물질의 대부분의 제거를 포함한 위상.
Acknowledgments
우리가 그들의 기술 출자를위한 Servane Contal와 보리스 Untereiner 감사드립니다. 우리는 FNR "FUTOX"프로젝트의 지원을 인정합니다.
Materials
Media and solutions PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water. Toxin inducing media: 1g K2HPO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4 7H2O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water. Lysis Buffer:
Precipitation Buffer:
Washing Buffer:
Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):
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References
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