Summary
Este video muestra la forma de encapsular las células de cáncer en la cultura PuraMatrix, un auto disponible en el mercado montaje de gel de péptido.
Abstract
Evidencia creciente sugiere que las células del cáncer de cultivo en tres dimensiones con mayor precisión recapitula la complejidad de la biología del tumor. Muchos de estos modelos utilizan la membrana basal reconstituida procede de animales que contienen una cantidad variable de factores de crecimiento y citoquinas que pueden influir en el crecimiento de estos modelos de cultivo celular. A continuación, describimos en detalle la preparación y el uso de PuraMatrix, un auto disponible en el mercado montaje de gel de péptido que carece de origen animal y material de los agentes patógenos para encapsular y propagar el cáncer de ovario línea celular, OVCAR-5. Comenzaremos por describir la forma de preparar el PuraMatrix antes de su uso. A continuación, se demuestra cómo mezclar la PuraMatrix y la suspensión celular para encapsular las células en el hidrogel. Tras la adición de medios de cultivo celular o inyección en un entorno fisiológico, el componente de péptidos de PuraMatrix rápidamente sí se constituye en un hidrogel en 3D que muestra a escala nanométrica estructura fibrosa con un tamaño de poro promedio de 500 a 200 nm
Protocol
Notas técnicas:
- Gelificación se inicia por la adición de sales. Por lo tanto, es fundamental que no sales de entrar en contacto con PuraMatrix hasta la gelificación se desea, la exposición a las sales de la fuerza iónica muy baja (por ejemplo, <0,05 M) causará gelificación irreversible.
- Soluciones sobrantes de acciones que se prepara puede ser utilizado en una fecha posterior siempre que no hayan estado en contacto con las sales. Usted no necesita preocuparse por sonicación repetir.
- Las burbujas de aire se puede quitar PuraMatrix alícuotas en tubos estériles, seguido por centrifugación.
- Tenga mucho cuidado durante los cambios de los medios de comunicación como la aspiración puede alterar la cama PuraMatrix.
Materiales:
BD PuraMatrix péptido RAD16 hidrogel-1% (Cat # 354 250): La concentración de péptido total de la mezcla no diluida es de 10 mg / ml.
- Agua baño de ultrasonido o Vortex
- 96 y placa de cultivo celular
- Medios de cultivo celular
- Estéril filtrado H 2 O
- Filtrado estéril de sacarosa al 20%
- Las células (todas menos 5.000 células / pocillo): OVCAR-5
Todos los pasos se deben realizar en condiciones asépticas.
Procedimiento:
- Sonicar la PuraMatrix 1% (RAD16) en un baño de ultrasonido agua durante 30 minutos para reducir la viscosidad antes de su uso.
- La solución PuraMatrix 1% ahora se puede alícuotas en tubos estériles para simplificar los experimentos futuros.
- Evitar la formación de burbujas de aire, si se forman sólo hacen girar por los tubos estériles que contengan PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) durante 5 minutos.
- La concentración de péptido total de la mezcla no diluida es de 10 mg / ml.
- Dos grupos de cuatro pozos se sembraron a 2,5 mg / ml y 1,25 mg / ml de concentración de péptido total, respectivamente.
- Diluir la PuraMatrix en cada pocillo conjunto con 0,2 micras estéril sacarosa filtrado del 20% y el 13,3% de sacarosa con el total de concentraciones de péptido de 5 mg / ml y 2,5 mg / ml, respectivamente, para alcanzar una concentración de 2x BD PuraMatrix en 10% de sacarosa.
- Hacer 20% de sacarosa, diluir 10 g de sacarosa, entonces el volumen de 50 ml de agua.
- 13% y 10% de sacarosa se puede preparar por dilución de la solución de reserva del 20%.
- 13% de sacarosa (por cada 10 ml): 6,5 ml de sacarosa al 20% + 3,5 ml estéril H 2 O.
- 10% de sacarosa (por cada 10 ml): 5,0 ml de sacarosa al 20% + 5.0 ml estéril H 2 O.
- Prepare una mezcla maestra de péptido PuraMatrix basado en el número de pozos tiene la intención de la placa. (Véase el siguiente ejemplo.) Luego alícuotas en tubos individuales que contienen 25 ml de la mezcla maestra.
- La mezcla maestra debe estar preparado el doble de la concentración final deseada de péptido total, ya que se diluye con un volumen igual de células durante el recubrimiento.
- La mezcla maestra debe estar preparado el doble de la concentración final deseada de péptido total, ya que se diluye con un volumen igual de células durante el recubrimiento.
- Preparar las suspensiones de células de cultivos celulares de células trypsinizing monocapa.
- 2 ml de 0,05% de tripsina EDTA se puede utilizar para cada frasco T-75.
- Neutralizar la tripsina mediante la adición de medios de cultivo celular que contiene 10% inactivado por calor suero fetal bovino (uso de al menos 2 ml de los medios de comunicación por ml de tripsina utilizada en el paso anterior.)
- Centrifugar las células a 1000 rpm (~ 300 xg) durante 5 minutos para crear un sedimento celular.
- Resuspender las células en estéril de sacarosa al 10% se filtra.
- Contar las células y girar de nuevo a 1000 rpm (~ 300 xg) durante 5 minutos para eliminar pequeñas cantidades de sal en los medios de comunicación.
- Resuspender las células OVCAR-5 en el 10% de sacarosa en 2,0 x 10 5 células / ml por lo que el número final de células por pozo será de 5.000 células en cada pocillo.
Los siguientes pasos deben llevarse a cabo rápidamente. - Añadir 25 l de la x 2.0 10 5 células / ml de suspensión en el primer tubo individuales con 25 l de la mezcla maestra de PuraMatrix como se muestra en el esquema de arriba.
- Rápidamente la mezcla con la pipeta (~ 5 veces arriba y abajo) en el tubo sin introducir burbujas de aire.
- A continuación, una pipeta de 50 l de suspensión celular / PuraMatrix mezcla en el pozo apropiado de un plato de 96 pozos.
- Iniciar la gelificación de la PuraMatrix BD pipeteando suavemente 150 medios de comunicación l cultivo de células (RPMI + 10% FBS) al lado del pozo
- Repita los pasos descritos en el 8 hasta que todos los pozos se han plateado.
- Después de 30 minutos muy suavemente quitar ~ 2 / 3 de los medios de comunicación con una pipeta 200 l para equilibrar el pH del hidrogel.
- NO USE una aspiradora, ya que esto INTERRUMPIR LA MATRIZ
- Coloque la punta de la pipeta en el pozo para que no toque la cama PuraMatrix y retire con cuidado los medios de comunicación desde el pozo.
- Se debe tener cuidado para no alterar la matriz durante el cultivo de células en PuraMatrix.
- Muy suavemente añadir 150 l de nuevo medio de cultivo celular al lado de las células y que contiene encapsulado en PuraMatrix.
- Cambiar el medio de cultivo celular en cada pocillo cada 48 horas con medio de cultivo fresco con cuidado de repetir los pasos 10 y 11.
Los resultados representativos:
Figura 1. OVCAR-5 células fueron encapsulados como se describe en el protocolo anterior. Las imágenes fueron adquiridas con un invertido Olympus FV1000 microscopio equipado con Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire láser sintonizado a 750 nm. Sesiones de formación de imágenes se llevaron a cabo los días 1, 3, 5 y 7 días después de galvanoplastia. A larga distancia de trabajo, el agua mojando objetivo de 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) fue utilizado para la imagen a través de la PuraMatrix. Volúmenes tridimensionales fueron recogidos por la adquisición de las pilas de la imagen en 1,47 micras pasos axial. Dos no descanned detectores de recogida de la emisión de la autofluorescencia de violeta (440 hasta 490 nm) y verde (510-550 nm) filtros de paso de banda. Las imágenes finales y películas profundidad de la pila se procesaron con ImageJ mediante la combinación de los dos canales de detección.
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
