Biology

PuraMatrix تغليف الخلايا السرطانية

Published: December 17, 2009 doi: 10.3791/1692

Adnan O. Abu-Yousif¹, Imran Rizvi^1,2, Conor L. Evans¹, Jonathan P. Celli¹, Tayyaba Hasan^1,3

¹Wellman Center for Photomedicine Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Thayer School of Engineering, Dartmouth College, ³Department of Dermatology, Harvard Medical School

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية تغليف الخلايا السرطانية والثقافة في PuraMatrix ، وهي متوفرة تجاريا الذاتي تجميع جل الببتيد.

Abstract

أدلة متزايدة تشير إلى أن زراعة الخلايا السرطانية في ثلاثة أبعاد أكثر دقة يلخص تعقيد البيولوجيا الورم. كثير من هذه النماذج تستخدم تشكيل الغشاء القاعدي المستمدة من الحيوانات التي تحتوي على كميات متفاوتة من عوامل النمو والسيتوكينات التي يمكن أن تؤثر على نمو هذه النماذج ثقافة الخلية. هنا ، نحن تصف بالتفصيل إعداد واستخدام PuraMatrix ، وهي متوفرة تجاريا هلام الذاتي تجميع الببتيد التي تخلو من الحيوانات المستمدة من المواد والعوامل الممرضة لتغليف ونشر الخلايا السرطانية خط المبيض ، OVCAR - 5. نبدأ تصف كيفية إعداد PuraMatrix قبل الاستخدام. المقبل ، ونحن لشرح كيفية مزج صحيح PuraMatrix وتعليق خلية لتغليف الخلايا في هيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك على وسائل الإعلام أو الثقافة حقن الخلايا في بيئة الفسيولوجية ، المكون من الببتيد PuraMatrix بسرعة النفس تجمع في هيدروجيل 3D أن يسلك الليفية مقياس النانومتر هيكل مع متوسط حجم المسام من 500-200 نانومتر

Protocol

ملاحظات فنية :

يبدأ تهليم من خلال إضافة الأملاح. لذا ، فمن الأهمية بمكان أن لا أملاح تأتي في اتصال مع PuraMatrix هو المطلوب حتى تهليم ؛ التعرض للأملاح أيونية قوة منخفضة جدا (على سبيل المثال ، <0.05 م) سوف يتسبب تهليم لا رجعة فيه.
ويمكن استخدام الحلول الأسهم المتبقية التي يتم إعدادها في وقت لاحق شريطة ألا يكونوا قد تأتي في اتصال مع الأملاح. كنت لا داعي للقلق بشأن صوتنة تكرار.
ويمكن إزالة فقاعات الهواء aliquoting PuraMatrix في أنابيب معقمة تليها الطرد المركزي.
نكون حذرين للغاية خلال التغييرات وسائل الاعلام كما يمكن أن يحدث خللا تطلع بسهولة PuraMatrix السرير.

المواد :

دينار بحريني الببتيد RAD16 PuraMatrix هيدروجيل - 1 ٪ (القط # 354250) : إن تركيز الببتيد الإجمالية للخليط مخفف هو 10 ملغ / مل.

المياه Sonicator حمام أو دوامة
96 - جيدا ثقافة خلية طبق
خلية ثقافة وسائل الإعلام
معقمة المصفاة H ₂ O
معقمة المصفاة السكروز 20 ٪
خلايا (جميع الخلايا في 5000 / إضافة) : OVCAR - 5

يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة.

الإجراء :

يصوتن للPuraMatrix 1 ٪ (RAD16) في المياه sonicator الحمام لمدة 30 دقيقة لتقليل اللزوجة قبل الاستخدام.
ويمكن الآن حل PuraMatrix 1 ٪ يكون في أنابيب معقمة aliquoted لتبسيط التجارب في المستقبل.
1. تجنب تكون فقاعات الهواء ، وإذا كانت تدور ببساطة شكل أسفل أنابيب معقمة تحتوي PuraMatrix دورة في الدقيقة 1000 (300 x ج) لمدة 5 دقائق.
2. تركيز الببتيد الإجمالية للخليط مخفف هو 10 ملغ / مل.
وسيتم مطلي مجموعتين من 4 آبار بنسبة 2.5 ملغ / مل و 1.25 ملغ / مل تركيز الببتيد المجموع ، على التوالي.
تمييع PuraMatrix في كل مجموعة بشكل جيد مع 0.2 ميكرون معقمة تصفيتها السكروز 20 ٪ و 13.3 ٪ سكروز لتركيزات الببتيد مجموعه 5 مل / ملغ و 2.5 ملغ / مل على التوالي لتحقيق تركيز 2X من PuraMatrix دينار بحريني في السكروز 10 ٪.
1. جعل السكروز 20 ٪ ، 10 غراما من تمييع السكروز ، ثم وحدة التخزين إلى 50 مل من الماء.
2. يمكن إعداد 13 ٪ و 10 ٪ سكروز تمييع الحل الأسهم 20 ٪.
  1. السكروز 13 ٪ (مقابل كل مل 10) : 6.5 مل السكروز 20 ٪ + 3.5 مل العقيمة H ₂ O.
  2. 10 ٪ سكروز (لكل 10 مل) : 5.0 مل السكروز 20 ٪ + 5.0 مل العقيمة H ₂ O.
تحضير مزيج سيد الببتيد PuraMatrix استنادا إلى عدد من الآبار التي تنوي لوحة. (انظر المثال أدناه). ثم قسامة في أنابيب الفردية التي تحتوي على 25 مل من مزيج الرئيسي.
1. وينبغي إعداد هذا المزيج الرئيسي في ضعف التركيز النهائي المطلوب من مجموع الببتيد كما سيتم تخفيفه مع حجم مساو من خلايا أثناء الطلاء.
إعداد تعليق خلية خلية خلية trypsinizing الثقافات أحادي الطبقة.
1. ويمكن استخدام 2 مل من 0.05 ٪ التربسين EDTA لكل قارورة T - 75.
تحييد التربسين من قبل وسائل الإعلام بالإضافة إلى زراعة الخلايا التي تحتوي على 10 ٪ الحرارة المعطل الجنين المصل البقري (استخدم ما لا يقل عن 2 مل من وسائل الإعلام لكل مل من التربسين المستخدمة في الخطوة السابقة).
الطرد المركزي الخلايا الدقيقة في 1000 (~ 300 x ج) لمدة 5 دقائق لإنشاء خلية بيليه.
1. Resuspend الخلايا في السكروز 10 ٪ العقيمة التي تمت تصفيتها.
2. عدد الخلايا وتدور مرة أخرى في أسفل دورة في الدقيقة 1000 (~ 300 x ج) لمدة 5 دقائق لإزالة كميات ضئيلة من الملح وجدت في وسائل الإعلام.
Resuspend الخلايا OVCAR - 5 في السكروز 10 ٪ في الدورة العاشرة لل2.0 10 ⁵ خلية / مل بحيث الفرز النهائي في الخلية جيدا وسوف 5000 الخلايا في كل بئر.

يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية بسرعة.
إضافة ميكرولتر من 25 س 2.0 10 ⁵ خلية / مل تعليق لأنبوب الفرد الأول الذي يحتوي 25 ميكروليتر من مزيج سيد PuraMatrix كما هو موضح في التخطيطي أعلاه.
1. المزيج بسرعة pipetting (~ 5 مرات صعودا وهبوطا) في أنبوب دون إدخال فقاعات الهواء.
2. ماصة ثم 50 ميكرولتر الخلية تعليق / PuraMatrix الخليط المناسب من البئر 96 طبق بشكل جيد.
3. بدء تهليم من PuraMatrix دينار بحريني من قبل pipetting بلطف ميكرولتر 150 خلية ثقافة وسائل الإعلام (+ 10 ٪ RPMI FBS) إلى جانب البئر
كرر الخطوات المذكورة في 8 حتى تم مطلي جميع الآبار.
بعد 30 دقيقة جدا إزالة برفق ~ 2 / 3 من وسائل الإعلام باستخدام ماصة 200 ميكرولتر للتوازن الرقم الهيدروجيني للهيدروجيل.
1. لا تستخدم الشافطة الكهربائية حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل ماتركس
2. مكان غيض ماصة في البئر بحيثلا تلمس السرير برفق PuraMatrix وإزالة وسائل الاعلام من البئر.
3. ينبغي الحرص على عدم تعطيل المصفوفة خلال ثقافة الخلايا في PuraMatrix.
إضافة جدا برفق 150 ميكرولتر من خلية ثقافة جديدة وسائل الاعلام الى جانب الخلايا التي تحتوي كذلك مغلفة في PuraMatrix.
تغيير ثقافة وسائل الإعلام في كل خلية ساعة كل 48 جيدا مع وسائل الاعلام ثقافة جديدة بتكرار الخطوات بعناية 10 و 11.

ممثل النتائج :

الشكل 1. كانت مغلفة OVCAR - 5 الخلايا كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب أوليمبوس FV1000 مجهزة تي DeepSee الأطياف ، فيزياء : الياقوت الليزر ضبطها إلى 750 نانومتر. وأجريت دورات التصوير في أيام 1 و 3 و 5 و 7 بعد الطلاء. واستخدمت مسافة طويلة في العمل ، والمياه غمس الهدف 40X (0.8 أوليمبوس LUMPLFLN NA) لصورة من خلال PuraMatrix. جمعت ثلاثي الأبعاد من خلال الحصول على كميات مداخن الصورة في الخطوات 1.47 ميكرون المحوري. جمعت اثنين من غير descanned كشف عن انبعاث تألق ذاتي باستخدام البنفسجي (440-490 نانومتر) والأخضر (510-550 نانومتر) مرشحات ممر الموجة. تمت معالجة الصور والأفلام النهائي عمق المكدس باستخدام ImageJ عن طريق الجمع بين كل من قنوات الكشف. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.