Summary
Deze video laat zien hoe u in te kapselen en cultuur kankercellen in PuraMatrix, een commercieel verkrijgbaar zelfassemblerende peptide gel.
Abstract
Steeds meer gegevens wijzen erop dat het kweken van kankercellen in drie dimensies nauwkeuriger recapituleert de complexiteit van de tumor biologie. Veel van deze modellen maken gebruik van gereconstitueerde basaalmembraan afkomstig van dieren die een variabel bedrag van groeifactoren en cytokinen die de groei van deze celcultuur modellen kunnen beïnvloeden bevatten. Hier beschrijven we in detail de bereiding en het gebruik van PuraMatrix, een in de handel verkrijgbaar zelfassemblerende peptide gel die verstoken is van dierlijke materiaal en ziekteverwekkers te integreren en te verspreiden van de eierstokkanker cellijn, OVCAR-5. We beginnen met de beschrijving van hoe de PuraMatrix voor te bereiden voor gebruik. Vervolgens laten we zien hoe goed de PuraMatrix en celsuspensie mix om de cellen in te kapselen in de hydrogel. Na de toevoeging van celkweek media of een injectie in een fysiologische omgeving, de peptide component van PuraMatrix snel zelf assembleert in een 3D-hydrogel dat een nanometer schaal vezelachtige structuur vertoont met een gemiddelde poriegrootte van 500 tot 200 nm
Protocol
Technische opmerkingen:
- Gelering wordt geïnitieerd door de toevoeging van zouten. Daarom is het essentieel dat er geen zouten in contact komen met PuraMatrix tot gelering is gewenst, de blootstelling aan zouten van zeer lage ionische sterkte (bijv. <0.05 M) zal leiden tot onherstelbare gelering.
- Overgebleven voorraad oplossingen die zijn voorbereid kan worden gebruikt op een later tijdstip op voorwaarde dat zij niet in contact komen met zouten. U hoeft geen zorgen te maken over te herhalen ultrasoonapparaat.
- Luchtbellen kunnen verwijderd worden aliquoting PuraMatrix in steriele buizen, gevolgd door centrifugeren.
- Wees zeer voorzichtig tijdens het verwisselen van media zoals aspiratie kan gemakkelijk verstoren de PuraMatrix bed.
Materialen:
BD PuraMatrix RAD16 Peptide Hydrogel-1% (Cat # 354250): De totale peptide concentratie van het onverdunde mengsel wordt 10 mg / ml.
- Water Bath ultrasoonapparaat of Vortex
- 96-well celkweek schotel
- Cel Cultuur Media
- Steriel gefiltreerd H 2 O
- Steriel gefiltreerd 20% Sucrose
- Cellen (alle bij 5.000 cellen / putje): OVCAR-5
Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
Procedure:
- Ultrasone trillingen van de 1% PuraMatrix (RAD16) in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 30 minuten om de viscositeit te verminderen alvorens te gebruiken.
- De 1%-oplossing PuraMatrix kan nu worden in hoeveelheden verdeeld in steriele buizen aan toekomstige experimenten te vereenvoudigen.
- Vermijd de vorming van luchtbellen, als ze vormen gewoon spin down van de steriele buisjes met PuraMatrix bij 1000 rpm (300 xg) voor 5 minuten.
- De totale peptide concentratie van het onverdunde mengsel wordt 10 mg / ml.
- Twee sets van vier putten zullen worden verzilverd met 2,5 mg / ml en 1,25 mg / ml totaal peptide concentratie, respectievelijk.
- Verdun de PuraMatrix in elk putje set met 0,2 micrometer steriel gefiltreerd 20% sucrose en 13,3% sucrose aan de totale peptide concentraties van 5 mg / ml en 2,5 mg / ml, respectievelijk een 2x concentratie van BD PuraMatrix te bereiken in 10% sucrose.
- Maak tot 20% sucrose, verdunnen 10 g sucrose, dan is het volume op 50 ml water.
- 13% en 10% sucrose kan worden bereid door verdunning van de 20% stamoplossing.
- 13% Sucrose (per 10 ml): 6,5 ml 20% sucrose + 3,5 ml steriele H 2 O.
- 10% Sucrose (per 10 ml): 5,0 ml 20% sucrose + 5,0 ml steriele H 2 O.
- Bereid een meester mix van PuraMatrix peptide op basis van het aantal putten u van plan bent om te plaat. (Zie onderstaande voorbeeld.) Dan aliquot in afzonderlijke buizen die 25 ml van de master mix.
- De master mix moeten worden voorbereid op tweemaal de gewenste uiteindelijke concentratie van het totaal peptide zoals het zal worden verdund met een gelijk volume van cellen tijdens de plating.
- De master mix moeten worden voorbereid op tweemaal de gewenste uiteindelijke concentratie van het totaal peptide zoals het zal worden verdund met een gelijk volume van cellen tijdens de plating.
- Bereid celsuspensies door trypsinizing celmonolaag celculturen.
- 2 ml van 0,05% trypsine EDTA kan worden gebruikt voor elke T-75 kolf.
- Neutraliseer de trypsine door toevoeging van media voor celkweek met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (gebruik ten minste 2 ml van de media per ml trypsine gebruikt in de vorige stap.)
- Centrifugeer de cellen bij 1000 tpm (~ 300 xg) voor 5 minuten om een cel pellet te creëren.
- Resuspendeer de cellen in 10% steriel gefiltreerd sucrose.
- Tel het aantal cellen en weer spin down bij 1000 rpm (~ 300 xg) voor 5 minuten om sporen van zout in de media te verwijderen.
- Resuspendeer de OVCAR-5-cellen in 10% sucrose op 2,0 x 10 5 cellen / ml, zodat het uiteindelijke aantal cellen per goed zal 5.000 cellen worden in elk putje.
De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd. - Voeg 25 ul van de 2,0 x 10 5 cellen / ml suspensie aan de eerste persoon buis met 25 ul van de master mix van PuraMatrix zoals weergegeven in het bovenstaande schema.
- Snel mix door pipetteren (~ 5 keer op en neer) in de buis zonder dat er luchtbellen.
- Dan pipet de 50 ui celsuspensie / PuraMatrix mengsel in de juiste well van een 96 goed gerecht.
- Initiëren gelering van de BD PuraMatrix door voorzichtig pipetteren 150 ul van media voor celkweek (RPMI + 10% FBS) aan de zijkant van de put
- Herhaal de stappen die in acht tot alle bronnen zijn verguld.
- Na 30 minuten heel zachtjes te verwijderen ~ 2 / 3 van de media met een 200 ul pipet om de pH van de hydrogel evenwicht.
- GEBRUIK GEEN VACUUM aspirator omdat dit de MATRIX VERSTOREN
- Plaats de pipet tip in de put, zodathet doet niet aan de PuraMatrix bed en voorzichtig media te verwijderen uit de put.
- Zorg moet worden genomen om de matrix niet verstoren tijdens de cultuur van de cellen in PuraMatrix.
- Heel voorzichtig voeg 150 ul van verse media voor celkweek aan de zijkant van het putje met cellen ingekapseld in PuraMatrix.
- Wijzig de celkweek media in elk putje om de 48 uur met verse cultuur media door zorgvuldig te herhalen stap 10 en 11.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. OVCAR-5 cellen werden ingekapseld zoals beschreven in de bovenstaande protocol. Beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde Olympus FV1000 microscoop uitgerust met Spectra-Physics DeepSee Ti: saffier laser afgestemd op 750 nm. Imaging sessies werden uitgevoerd op dag 1, 3, 5 en 7 post-plating. Een lange werkafstand, water dompelen 40x objectief (Olympus LUMPLFLN 0.8 NA) werd gebruikt om de afbeelding door de PuraMatrix. Drie-dimensionale volumes werden verzameld door de overname van image stacks in 1,47 micrometer axiale stappen. Twee niet-descanned detectoren verzamelde de autofluorescentie-emissie met behulp van violet (440-490 nm) en groen (510-550 nm) banddoorlaatfilters. De laatste foto's en diepte-stack films werden verwerkt met behulp van ImageJ door combinatie van beide detectie-kanalen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
