Summary
이 동영상은 PuraMatrix, 펩타이드 젤 조립 시판 자체 캡슐 문화 암세포하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
증가 증거 recapitulates 종양 생물학의 복잡보다 정확하게 3 차원에 해당 culturing의 암 세포를 제안합니다. 이러한 모델의 대부분은 이러한 세포 배양 모델의 성장에 영향을 미칠 수 성장 요인과 크린 시토킨의 변수 금액을 포함하는 동물에서 파생된 재구성 지하 막을 활용한다. 여기서는 자세하게 설명 PuraMatrix, 동물 파생 자료와 난소암 세포 라인, OVCAR - 5 캡슐하고 전파하는 병원균의 찾아볼 수있는 상용 자기 조립 펩티드 젤의 준비와 사용합니다. 우리는 사용하기 전에 PuraMatrix를 준비하는 방법을 설명하여 시작합니다. 다음, 우리는 제대로 히드로겔에있는 세포를 캡슐로 PuraMatrix와 세포 현탁액을 혼합하는 방법을 보여줍니다. 생리적 환경으로 세포 배양 미디어 또는 분사의 추가시 PuraMatrix의 펩타이드 성분이 빠르게 자체 5-200 NM의 평균 기공 크기가 나노미터 규모의 섬유 구조를 전시하고 3D 히드로겔로 조립
Protocol
테크니컬 노트 :
- 겔화는 소금의 추가에 의해 시작됩니다. 따라서 겔화가 원하는 때까지는 아무 소금이 PuraMatrix와 접촉하지 않는 것이 중요합니다, 매우 낮은 이온 강도의 염 (예를 들어, <0.05 M)에 대한 노출은 돌이킬 수 겔화의 원인이됩니다.
- 준비가되어 남은 주식 솔루션들은 소금과 접촉하지 않은 제공 나중에 사용할 수 있습니다. 당신은 반복 sonication 걱정할 필요가 없습니다.
- 공기 방울은 원심 분리에 의해 다음 멸균 튜브에 PuraMatrix를 aliquoting 제거할 수 있습니다.
- 흡인 쉽게 PuraMatrix 침대를 중단 수있는 미디어를 변경하는 동안 매우주의하십시오.
자료 :
BD PuraMatrix RAD16의 펩타이드 히드로겔 - 1 % (고양이 # 354250) : undiluted 혼합물의 총 펩타이드의 농도는 10 MG / ML입니다.
- 워터 목욕 Sonicator 또는 소용돌이
- 96 - 웰 세포 배양 접시
- 세포 배양 미디어
- 멸균 필터링 H 2 O
- 무균 필터링된 20 % 자당
- 셀 (전체 5,000 세포에 / 잘) OVCAR - 5
모든 단계는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
절차 :
- 사용하기 전에 점도를 줄이기 위해 30 분 물 목욕 sonicator의 1 % PuraMatrix (RAD16)를 Sonicate.
- 1 % PuraMatrix 솔루션은 이제 미래의 실험을 단순화하기 위해 멸균 튜브에 aliquoted 수 있습니다.
- 공기 거품의 형성을 피하, 그들이 양식을 경우에는 간단하게 5 분 1,000 RPM (300 XG)에서 PuraMatrix를 포함하는 멸균 튜브를 스핀 다운.
- undiluted 혼합물의 총 펩타이드의 농도는 10 MG / ML입니다.
- 4 웰스 두 세트는 각각 2.5 MG / ML 및 1.25 MG / ML 총 펩타이드 농도에서 도금한다.
- 10 %의 자당의 BD PuraMatrix의 2 배 농도를 달성하기 위해 각각 잘 0.2 μm의 5 MG / ML 2.5 MG / ML 총 펩타이드 농도로 멸균 필터링 20 % 자당 및 13.3 %의 자당 설정된 각 PuraMatrix을 희석.
- 20 %의 자당을 만들려면 다음 자당의 10g, 볼륨 50 ML 물로 희석.
- 13 %, 10 %의 자당은 20 % 주식 솔루션을 diluting으로 준비하실 수 있습니다.
- 13 % 자당 (매 10 ML 용) : 6.5 ML 20 %의 자당 + 3.5 ML 살균 H 2 O.
- 10% 자당 (매 10 ML 용) : 5.0 ML 20 %의 자당 + 5.0 ML 살균 H 2 O.
- 당신이 접시하고자하는 우물의 숫자에 따라 PuraMatrix의 펩타이드의 마스터 믹스를 준비합니다. (아래 예제 참조). 그리고 마스터 믹스 25 ML을 포함하는 각각의 튜브로 나누어지는.
- 그것이 도금하는 동안 세포의 동일한 볼륨에 희석 수로 마스터 믹스는 총 펩타이드의 두배가 원하는 최종 농도에서 준비되어야합니다.
- 그것이 도금하는 동안 세포의 동일한 볼륨에 희석 수로 마스터 믹스는 총 펩타이드의 두배가 원하는 최종 농도에서 준비되어야합니다.
- 세포 monolayer 셀 문화를 trypsinizing하여 셀 suspensions를 준비합니다.
- 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 ML 각 T - 75 플래 사용할 수 있습니다.
- 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청을 (이전 단계에서 사용되는 트립신의 ML 당 미디어 최소한 2 ML)을 사용합니다. 포함된 세포 배양 매체 이외에 의해 트립신을 중화
- 세포 펠렛을 만드는 5 분 1,000 RPM (~ 300 XG)에서 세포를 원심 분리기.
- 10% 멸균 필터링 자당의 세포를 Resuspend.
- 세포를 카운트하고 미디어에있는 소금 성분을 제거하는 5 분 1,000 RPM (~ 300 XG)에서 다시 다운 스핀.
- 물론 당 최종 셀 개수는 각 우물에 5,000 세포됩니다 5 전지 / ML 있도록 2.0 X 10 10 %의 자당의 OVCAR - 5 세포를 Resuspend.
다음 단계는 급속하게 수행하여야한다. - 로 위의 설계도에 표시된 PuraMatrix의 마스터 믹스 25 μl를 포함하는 첫 번째 개인 튜브에 2.0 X 10 5 셀 / ML 정지 25 μl를 추가합니다.
- 신속하게 공기 방울을 도입하지 않고 튜브 pipetting (위, 아래로 ~ 5 배)로 섞는다.
- 다음 96 잘 요리의 적절한 우물에 50 μl 세포 현탁액 / PuraMatrix 혼합물을 피펫.
- 부드럽게 잘 측면 150 μl 세포 배양 미디어 (RPMI + 10% FBS)을 pipetting하여 BD의 PuraMatrix의 겔화을 시작
- 모든 우물이 도금 때까지 8 설명한 단계를 반복합니다.
- 30 분 후에 아주 부드럽게 히드로겔의 산도를 평형에 200 μl 피펫을 사용하여 미디어의 ~ 2 / 3 제거합니다.
- 이것은 행렬을 방해하므로 진공 흡인기를 사용하지 마십시오
- 그래서 우물에 피펫 팁을 플레이스그것은 PuraMatrix 침대를 터치하고 부드럽게 우물에서 미디어를 제거하지 않습니다.
- 치료는 PuraMatrix에서 세포의 문화 중에 매트릭스를 방해하지 않도록 주의해야한다.
- 아주 부드럽게 PuraMatrix에 캡슐 잘 들어있는 세포의 측면으로 신선한 세포 배양 매체 150 μl를 추가합니다.
- 신중하게 단계 10 및 11를 반복하여 새로운 문화 매체와 각 잘마다 48 시간 이내에 세포 배양 매체를 변경합니다.
대표 결과 :
그림은 1. OVCAR - 5 세포는 위의 프로토콜에서 설명한대로 캡슐되었습니다. 사파이어 레이저 750 nm의로 조정 : 이미지는 스펙트럼 - 물리 DeepSee 티 갖춘 거꾸로 올림푸스 FV1000 현미경을 사용하여 인수했다. 이미징 세션은 일 1, 3, 5 7 이후 도금을 실시했다. 40x 목적을 찍기 긴 작동 거리, 물 (올림푸스 LUMPLFLN 0.8 NA)는 PuraMatrix을 통해 이미지로 사용되었습니다. 입체적인 볼륨이 1.47 μm의 축 단계에서 이미지 스택을 인수함으로써 수집되었다. 투 비 descanned 감지기 바이올렛 (440-490 nm의)과 녹색 (510-550 NM) 대역 통과 필터를 사용하여 autofluorescence 방출을 수집했습니다. 최종 이미지와 깊이 스택 영화는 모두 탐지 채널을 결합하여 ImageJ를 사용하여 처리되었습니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
