Summary
Denna video visar hur du kapsla in och kultur cancerceller i PuraMatrix, en kommersiellt tillgänglig självaggregerande peptid gel.
Abstract
Ökande bevis tyder på att cellerna odling cancer i tre dimensioner mer exakt rekapitulerar komplexiteten i tumörbiologi. Många av dessa modeller använder färdigberedda basalmembranet som härrör från djur som innehåller en varierande mängd tillväxtfaktorer och cytokiner som kan påverka tillväxten av dessa modeller cellkultur. Här beskriver vi i detalj beredning och användning av PuraMatrix, en kommersiellt tillgänglig självaggregerande peptid gel som saknar animaliska material och patogener till att samla och sprida äggstockscancer linje cancercell, OVCAR-5. Vi börjar med att beskriva hur man kan förbereda PuraMatrix före användning. Därefter visar vi hur man korrekt att blanda PuraMatrix och cellsuspension att kapsla in cellerna i hydrogel. Vid tillägg av media cellodling eller injektion i en fysiologisk miljö, peptiden del av PuraMatrix snabbt själv monterar i en 3D-hydrogel som uppvisar en nanometer struktur skala fibrösa med en genomsnittlig porstorlek 500-200 nm
Protocol
Tekniska anm:
- Gelation initieras genom tillsats av salter. Därför är det viktigt att inga salter kommer i kontakt med PuraMatrix tills gelation önskas, exponering för salter av mycket låg jonstyrka (t.ex. <0,05 M) kommer att orsaka oåterkalleliga gelation.
- Överblivna stamlösningar som är beredda kan användas vid ett senare tillfälle förutsatt att de inte har kommit i kontakt med salter. Du behöver inte oroa dig för att upprepa sonication.
- Luftbubblor kan tas bort alikvotering PuraMatrix i sterila rör följt av centrifugering.
- Var mycket försiktig vid byte av medium som ambition lätt kan störa PuraMatrix sängen.
Material:
BD PuraMatrix RAD16 Peptid Hydrogel-1% (Cat # 354.250): Den totala peptid koncentrationen av det outspädda blandningen 10 mg / ml.
- Vattenbad Sonicator eller Vortex
- 96-och cellodling maträtt
- Cell Culture Media
- Sterila Filtrerad H 2 O
- Sterila Filtrerad 20% sackaros
- Celler (alla på 5000 celler / brunn): OVCAR-5
Alla steg måste utföras under aseptiska förhållanden.
Förfarande:
- Sonikera 1% PuraMatrix (RAD16) i ett vattenbad sonicator 30 minuter för att minska viskositeten före användning.
- Den 1% PuraMatrix lösning kan nu konstaterat i sterila rör för att förenkla framtida experiment.
- Undvik att luftbubblor bildas, om de utgör bara spinn ner den sterila rör med PuraMatrix vid 1000 rpm (300 xg) i 5 minuter.
- Den totala peptid koncentrationen av det outspädda blandningen 10 mg / ml.
- Två uppsättningar av 4 brunnar kommer att vara klädd på 2,5 mg / ml och 1,25 mg / ml totalt peptid koncentration, respektive.
- Späd PuraMatrix i varje brunn set med 0,2 ìm steril filtreras 20% sackaros och 13,3% sackaros till total peptid koncentrationer av 5 mg / ml och 2,5 mg / ml, respektive att åstadkomma en 2x koncentration av BD PuraMatrix i 10% sackaros.
- Att tjäna 20% sackaros, späd 10 g sackaros, därefter till 50 ml vatten.
- 13% och 10% sackaros kan beredd genom utspädning av 20% stamlösning.
- 13% sackaros (för varje 10 ml): 6,5 ml 20% sackaros + 3,5 ml sterilt H 2 O.
- 10% sackaros (för varje 10 ml): 5,0 ml 20% sackaros + 5,0 ml sterilt H 2 O.
- Förbered en mästare blandning av PuraMatrix peptid baserat på antalet brunnar du tänker tallrik. (Se exempel nedan.) Sen alikvot i enskilda provrör innehållande 25 ml av Master Mix.
- Master Mix ska vara beredd på dubbelt så önskade slutliga koncentrationen av totalt peptid eftersom det kommer att spädas med en lika stor mängd celler under plätering.
- Master Mix ska vara beredd på dubbelt så önskade slutliga koncentrationen av totalt peptid eftersom det kommer att spädas med en lika stor mängd celler under plätering.
- Förbered cellsuspensioner av trypsinizing cellkulturer monolager cell.
- 2 ml 0,05% Trypsin EDTA kan användas för varje T-75 kolven.
- Neutralisera trypsin genom tillsats av media cellkulturer som innehåller 10% värmeinaktiverad fetalt bovinserum (använd minst 2 ml av media per ml trypsin använts i föregående steg.)
- Centrifugera cellerna vid 1000 rpm (~ 300 xg) i 5 minuter för att skapa en cellpellet.
- Resuspendera cellerna i 10% filtrerad steril sackaros.
- Räkna celler och snurra ner igen vid 1000 rpm (~ 300 xg) i 5 minuter för att avlägsna spår av salt som finns i media.
- Resuspendera OVCAR-5 celler i 10% sackaros vid 2,0 x 10 5 celler / ml så att den slutliga celltal per brunn kommer att bli 5000 celler i varje brunn.
Följande steg skall utföras snabbt. - Tillsätt 25 ìl av 2,0 x 10 5 celler / ml suspension till den första personen röret med 25 l av befälhavaren mix av PuraMatrix som visas i ovanstående schema.
- Snabbt blanda genom att pipettera (~ 5 gånger upp och ner) i röret utan att introducera luftbubblor.
- Sedan Pipettera 50 l cellsuspension / PuraMatrix blandningen i rätt väl i en 96 bra maträtt.
- Initiera gelation av BD PuraMatrix genom att försiktigt pipettera 150 l media cellkultur (RPMI + 10% FBS) till sidan av brunnen
- Upprepa stegen i 8 tills alla brunnar har pläterat.
- Efter 30 minuter Mycket försiktigt bort ~ 2 / 3 av media med en 200 l pipett att balansera pH-värdet i hydrogel.
- ANVÄND INTE ett vakuum aspirator eftersom detta kommer att störa MATRIX
- Placera pipettspetsen i brunnen så attDen berör inte den PuraMatrix sängen och försiktigt bort media från brunnen.
- Försiktighet bör vidtas för att inte störa matrisen under den kultur av celler i PuraMatrix.
- Mycket försiktigt lägga 150 l färska medier cellodling på sidan av brunnen innehåller celler inkapslade i PuraMatrix.
- Ändra media cellodling i varje brunn var 48 timmar med färska närsubstrat genom att försiktigt upprepa steg 10 och 11.
Representativa resultat:
Figur 1. OVCAR-5 celler inkapslade som beskrivs i ovanstående protokoll. Bilderna har förvärvats med ett inverterat Olympus FV1000 mikroskop utrustat med Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire lasern inställd på 750 nm. Imaging sessioner genomfördes på dag 1, 3, 5 och 7 efter plätering. En lång arbetsavstånd, vatten doppning 40x mål (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) användes för att bilden genom PuraMatrix. Tredimensionella volymer samlades in genom att förvärva Bildstaplar i 1,47 ìm axiell steg. Två icke-descanned detektorer samlat autofluorescens utsläppen med violett (440-490 nm) och grön (510-550 nm) bandpassfilter. Den slutliga bilder och djup filmer stack behandlades med ImageJ genom att kombinera båda upptäckt kanaler. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
