Summary
نقدم إجراء التجارب لقياس الضغط الجزئي للأوكسجين (PO2) في الأوعية الدموية الدماغية استنادا الأوكسجين التي تعتمد على التبريد من تفسفر. وقد حددت إعداد الحيوان وإجراءات التصوير لكلا ميدانية واسعة من التصوير CCD القائم على ضوء PO2 في الفئران و2 - الفوتون التصوير القائم على الإثارة PO2 في الفئران.
Abstract
رصد خصائص spatiotemporal من الدم والأوكسجين الدماغي الأنسجة أمر حاسم لفهم أفضل للعلاقة الاعصاب الأيضية والأوعية الدموية. وسوف تطور طرائق جديدة لقياس PO2 مع رصد في وقت واحد من أكبر حقول PO2 النظر مع أعلى المكاني القرار و / أو الزمان تمكين مزيد من التبصر في سير عمل الدماغ الطبيعي ، وسوف يكون له أثر كبير أيضا على التشخيص والعلاج من أمراض عصبية وعائية مثل السكتة الدماغية ومرض الزهايمر ، وإصابات الرأس.
وقد أظهرت طرائق التصوير الضوئي إمكانات كبيرة لتوفير القرار spatiotemporal عالية والتصوير الكمي لPO2 القائمة على امتصاص الهيموغلوبين في نطاق الأشعة تحت الحمراء وضوحا وبالقرب من الطيف الضوئي. ومع ذلك ، والقياس المتعدد الأطياف من الأوكسجين في الدم الدماغي تعتمد على الهجرة الفوتون من خلال نسيج الدماغ نثر عالية. مطلوب عادة تقدير ونمذجة المعلمات الأنسجة البصرية ، والتي قد تخضع لتغييرات ديناميكية خلال التجربة ، على تقدير دقيق للالأوكسجين في الدم. من ناحية أخرى ، لا ينبغي تقدير الضغط الجزئي للأوكسجين (PO2) استنادا الأوكسجين التي تعتمد على التبريد من تفسفر تتأثر بشكل كبير من جراء التغييرات في المعلمات من النسيج البصري ، ويقدم قياس المطلق للPO2. وقد أثبتت النظم التجريبية التي تستخدم الأكسجين الأصباغ الحساسة في الدراسات المجراة من النسيج perfused وكذلك لرصد محتوى الأكسجين في الأنسجة الثقافات ، وتبين أن تبريد تفسفر هي تقنية قوية قادرة على التصوير الدقيق الأوكسجين في نطاق PO2 الفسيولوجية.
هنا علينا أن نظهر مع اثنين من طرائق التصوير المختلفة كيفية إجراء قياس PO2 في الأوعية الدموية القشرية على أساس التصوير عمر تفسفر. في أول مظاهرة نقدم حقل واسع من التصوير نظرا لPO2 على السطح القشري من الفئران. هذه الطريقة التجريبية والتصوير والإعداد بسيطة نسبيا استنادا إلى اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا وجهاز ليزر نابض خضراء. وقدم مثالا على رصد انتشار الاكتئاب القشرية على أساس عمر تفسفر صبغة R3 Oxyphor. في المظاهرة الثانية نقدم دقة عالية اثنين الفوتون PO2 تصوير الأوعية الدموية الدقيقة في القشرية على فأرة الحاسوب. يتضمن برنامج الإعداد التجريبية مخصصة بنيت 2 - الفوتون المجهر مع ليزر الفيمتو ثانية ، المغير الكهربائية الضوئية ، والفوتون العد المضاعف أنبوب الصورة. نقدم مثالا للتصوير التباين في PO2 microvasculature القشرية بما فيها الشعيرات الدموية ، وذلك باستخدام رواية PTP - C343 مع تعزيز الصبغة 2 - الفوتون المقطع العرضي الإثارة.
انقر هنا لعرض المقال حول تجميع ومعايرة Nanoprobes الفسفورية للتصوير الأوكسجين في النظم البيولوجية.
Protocol
1. مجال التصوير واسعة نظرا لPO2 في الأوعية الدموية القشرية من الفئران
- الفئران (250 -350 ز ز) في البداية مع isoflurane تخدير ، ومقسطر في شريان الفخذ والوريد لرصد معدل ضربات القلب وضغط الدم ، وغازات الدم ، فضلا عن التسريب في الوريد. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 0.1 يتم تنفيذ القصبة الهوائية ، والتهوية الفئران مع خليط من الهواء والأكسجين.
- وتؤخذ عينات من الدم لقياس غازات الدم كل دقيقة 30-45 ، ويتم ضبط التهوية والتخدير للحفاظ على غازات الدم ضمن نطاق الفسيولوجية طبيعية.
- ويتم إعداد نافذة مغلقة الجمجمة على 4 ملم الجداري العظام × 4 ملم في حجم التصوير. تتم إزالة العظام والجافية ويتم تعبئة إطار الجمجمة مع agarose 1.5 ٪ ومختومة مع ساترة المجهر. ويستخدم إضافية 1 مم ثقب لدغ 2 على العظم الجبهي للحث على لجنة التنمية المستدامة التي microinjection intracortical من بوكل (~ 10 ميكرولتر ، 1 M). يجب توخي الحذر الشديد لتجنب أي ضرر من الأوعية الدموية القشرية. قد الحرارة الزائدة والضغط الميكانيكي ، أو فترة وجيزة من نقص الأكسجة تسوية حاجز الدم في الدماغ وتسبب تسرب للصباغة من الأوعية الدموية في الفضاء خلالي.
- يتم وضع قناع من مواد شفافة بصريا حول النافذة في الجمجمة. الغرض من هذا القناع هو إشارة إلى استيعاب تفسفر الذي يخرج من الصبغة التي تسربت في الأنسجة من حواف هذه المسألة الجافية. الصبغة في الفضاء الخلالي هو مصدر تفسفر مشرقة جدا التي يمكن أن يفسد القياس. سطوع زيادة الصبغة في الفضاء الخلالي هو نتيجة لتراكم الصبغة في بيئة منخفضة الأوكسجين مع الضغط وانخفاض معدل التبريد. ولذلك فإن الضرر من الأوعية الدموية في تجربة معترف بها بسهولة عن طريق ظهور بقع تفسفر مشرق ، وفي هذه الحالة يتم رفض البيانات التجريبية.
- بعد الانتهاء من الجراحة ، ويتم التوقف عن isoflurane وتحولت إلى تخدير alphachloralose (50 مغ / كغ في الوريد بلعة تلتها 40 مغ / (كغم ح) التسريب).
- يتم نقل الحيوانات على عربة مع ضغط الدم التنفس الصناعي ، ومراقبة درجة الحرارة. في حين تنفس هواء الغرفة ، وسرعان ما انتقلت من الحيوان إلى الإعداد والتصوير وتثبيتها في مقياس الجريان مع الخليط المناسب من الهواء والأكسجين.
- يتم وضع الإطار التجسيمي الذي يحمل هذا الحيوان في إطار الهدف. ويتركز إطار الجمجمة في مجال الرؤية في إطار هدف وضعه موازية لطائرة التنسيق.
- تم تشغيل ليزر نابض على وتعيين إلى الحد الأدنى من الطاقة النبض. يتم توجيه الشعاع الضوئي نحو متر الطاقة والطاقة نبضة نبضة تسليمها الى العينة ويتم تعديل أنها ليست أكثر من 10 مللي جول / سم 2. تحولت المحطة الفضائية الدولية تركز شعاع على نافذة الجمجمة مع حدوث المائل بزاوية 60 درجة من ~ والمحطة الفضائية الدولية قبالة الليزر.
- يتم إجراء قياسات غاز الدم والتسويات للتهوية والتخدير حتى جميع المعلمات الفسيولوجية للحيوان تقع ضمن نطاق الفسيولوجية طبيعية.
- على افتراض أن حجم الدم حوالي 7 ٪ من وزن الجسم ، ويذوب مبلغ مناسب لتحقيق R3 Oxyphor تفسفر في 1 مل من المياه المالحة لتحقيق 4 × 10 م -5 الدم تركيز التحقيق. يتم حقن محلول التحقيق عبر الوريد الفخذي.
- ويتم إعداد حل 1 م من كلوريد البوتاسيوم ويحقن ~ 1 UL مع حقنة من خلال ثقب لدغ على العظم الجبهي للحث على لجنة التنمية المستدامة.
- يتم تشغيل الليزر وبدأت التصوير مباشرة بعد حقن محلول بوكل. أن يتم التصوير من خلال 10 دقيقة تفسفر ~.
- يتم إجراء قياس غازات الدم أخرى للتأكد من أن المعلمات الحيوان الفسيولوجية لا يزال ضمن المعدل الطبيعي.
- ويتم الحصول على عمر تفسفر لجميع بكسل في تركيب واحد الاضمحلال الأسي باستخدام الخطية المناسب مربع مع ترجيح الإحصائية في Matlab. يتم تحويل عمر تفسفر إلى القيم PO2 باستخدام التجريبية شتيرن فولمر تشبه علاقة (راجع أدناه).
2. ارتفاع القرار اثنين الفوتون PO2 التصوير في الأوعية الدموية الصغيرة القشرية للماوس
- الفئران هي تخدير مع مقسطر هو شريان الفخذ وisofluorene لرصد معدل ضربات القلب وضغط الدم ، وغازات الدم ، فضلا عن إدارة صباغة. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 0.1 والحيوانات التنفس بصورة تلقائية على مزيج من الهواء والأكسجين.
- ويتم إعداد الإطار الجمجمة وفقا لتقنية طورت في الأصل من قبل ديفيد كلاينفيلد وينفريد Denk. وينبغي اتخاذ رعاية جيدة لتجنب أي ضرر من الأوعية الدموية لمنع تسرب محتمل للصباغة في الفضاء خلالي.
- وتؤخذ عينات من الدم وقليلة لقياس غازات الدم أثناء إجراء إعداد كامل ويتم ضبط التهوية والتخدير للحفاظ على الغاز في الدموفاق ضمن نطاق الفسيولوجية طبيعية.
- يتم نقل الحيوانات إلى الإعداد والتصوير. يتم وضع إطار تعديل التجسيمي الذي يحمل هذا الحيوان في إطار الهدف. ويتركز إطار الجمجمة في مجال الرؤية في إطار الهدف أوليمبوس 4X وضعه موازية لطائرة التنسيق.
- أخذ صورة من النافذة في الجمجمة مع الكاميرا الرقمية من خلال العدسات ، ويتم استبدال هدف بهدف 4X 20X أوليمبوس (NA = 0.95).
- يتم إجراء قياسات غاز الدم والتسويات للتهوية والتخدير حتى جميع المعلمات الفسيولوجية للحيوان تقع ضمن مجموعة والفسيولوجية طبيعية.
- على افتراض أن حجم الدم حوالي 7 ٪ من وزن الجسم ، ومبلغ مناسب من تفسفر التحقيق PTP - C343 يذوب في 0.2 مل من المياه المالحة لتحقيق الدم ~ 15 ميكرومتر تركيز التحقيق. يتم حقن محلول التحقيق عن طريق الشريان الفخذي.
- تبدأ التجربة من خلال تحديد الفترات الزمنية المطلوبة للصبغة الإثارة وجمع الانبعاثات في كل بكسل.
- الحصول على فحص المسح الذي هو بطء مسح النقطية 2 الأبعاد للتسوس كثافة تفسفر أن يعرض الهيكل الأوعية الدموية في العمق الحالي. تم نقل موضوعي عمودي على نافذة الجمجمة (Z المحور) ويتم أخذ يمسح مسح بطيئة 2D تفسفر كثافة استخدام الطاقة في الحد الأدنى ليزر 840 نانومتر للعثور على الطائرة microvessels في التصوير.
- في كل عمق والتصوير ، وبناء على مسح لمسح تفسفر في ذلك العمق ، ويتم اختيار مجموعة من النقاط داخل الأوعية الدموية ، ويتم تكرار تسجيل تفسفر يضمحل عند كل نقطة لعدد محدد مسبقا من المتوسط.
- تعيين المبلغ المطلوب من المتوسط ، فاصل القياس ، ومدة التجربة والبدء في القياس. يتم الحصول على قياسات ص 2 في مواقع مختارة في الفاصل الزمني المحدد لقياس مدة التجربة.
- خلال القياسات ، وبرامج إعادة توجيه الليزر الإثارة إلى المواقع المحددة من خلال تغيير موقف المرايا الجلفانومتر المسح. تتم السيطرة على الماسحات الضوئية الجلفانومتر ، المغير البصرية والكهربائية وجميع المعدات الأخرى العرف المحرز في برامج LABVIEW.
- ويتم الحصول على عمر تفسفر لجميع النقاط التي اختارتها تركيب الاضمحلال الأسي واحد باستخدام مربع الخطية المناسب في Matlab. يتم تحويل عمر تفسفر إلى القيم PO2 باستخدام التجريبية شتيرن فولمر تشبه علاقة (راجع أدناه).
- بعد جمع البيانات على أعماق مختلفة القشرية ، وضخ ديكستران - مترافق صبغة في الأوعية الدموية فلوريسئين للتصوير هيكل microvasculature.
- الحصول على كومة من الصور الهيكلية للالأوعية الدموية عن طريق تنفيذ التصوير اثنين من الفوتون مضان FITC استخدام قناة خضراء في الكشف عن أربع قنوات.
- وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اللجنة الفرعية مستشفى ماساتشوستس العام في رعاية الحيوان البحوث.
3. ممثل النتائج :
الشكل 1. الفريق (أ) على الجانب الأيسر من هذا الرقم يعرض حقل واسع من الصور نظرا لضغط الأكسجين قبل وصول موجة جنة التنمية المستدامة. لوحة (ب) على الجانب الأيمن يبين التطور الزمني للضغط الأكسجين المتوسط خلال نشر لجنة التنمية المستدامة في المنطقة من اهتمام ملحوظ على الفريق (أ).
الشكل 2 (افي الفيلم) : هذا الفيلم يبين التطور الزمني للضغط الأكسجين في نافذة الجمجمة كلها خلال انتشار موجة جنة التنمية المستدامة. شريط يشير مقياس ضغط الأكسجين في ملليمتر من الزئبق.
الشكل 3. الإسقاط 3D من المكدس تصوير الأوعية الدموية. ظلال من الرمادي تمثل قناعا الحجمي السفينة ، التي أنشئت على أساس الصورة الهيكلية. ص 2 قياس القيم هي مرمزة. شريط الحجم هو 200 ميكرومتر. طبع بإذن من مجموعة النشر الطبيعة. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثبتنا طلبين للقياس في PO2 microvasculature القشرية على أساس الأوكسجين التي تعتمد على التبريد من تفسفر. في حين أن الأسلوب الأول على أساس التصوير CCD يوفر مجالا واسعا للرصد ضوء PO2 ، وقياس الضغط الجزئي للأكسجين في microvasculature القشرية على أساس 2 الفوتون المجهري يوفر القرار الشعرية ويسمح التصوير في العمق. كلتا الطريقتين توفر سرعة عالية وعالية القياسات إشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى ذلك ، لقياس مدى الحياة من تفسفر PO2 غير حساس إلى حد كبير إلى التغييرات في المعلمات البصري للنسيج خلال التجربة ، التي عادة ما تكون مصدر قلق للتقنيات التصوير الضوئي الأخرى التي لديها آلية تقوم على النقيض من حدتها. قدم صكوك تسمح التحليل الكمي لإيصال الأوكسجين ودينامية عملية الأيض أنسجة الدماغ التي من شأنها أن تؤدي إلى فهم أفضل لاقتران عائية عصبية في الدماغ العادي والمريضة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف بدعم من المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح R01NS057476 ، P50NS010828 ، P01NS055104 ، R01EB000790 ، K99NS067050 ، وR01HL081273 R01EB007279 وجمعية القلب الأميركية 0855772D المنحة.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
