Summary
우리는 인광의 산소에 의존 담금질에 따라 대뇌 vasculature에서 산소의 부분 압력 (pO2)을 측정하는 실험 절차를 제시한다. 동물 준비 및 이미징 절차 쥐의 pO2 볼 때 CCD 기반 영상의 넓은 분야와 생쥐의 pO2의 2 광자 여기 기반 이미징 모두에게 설명했다.
Abstract
대뇌 혈액과 조직 산소의 spatiotemporal 특성의 모니터링은 신경 신진 대사 - 혈관 관계의 이해를 위해 매우 중요합니다. 높은 공간 및 / 또는 시간적 해상도로보기 큰 분야의 pO2 동시에 모니터링 새로운 pO2 측정 modalities의 개발은 정상적인 두뇌의 기능에 더 큰 통찰력을 사용하고 같은 neurovascular 질병의 진단과 치료에 상당한 영향을 미칠 것이다 또한 뇌졸중, 알츠하이머 병, 그리고 머리 부상.
광학 이미징 modalities는 광 스펙트럼의 가시 성과 가까운 적외선 범위에서 헤모글로빈의 흡수를 기반으로 높은 해상도와 spatiotemporal pO2의 양적 이미징을 제공하기 위해 큰 잠재력을 보여주었다. 그러나 대뇌 혈액 산소의 multispectral 측정 높은 산란 뇌 조직을 통해 광자 마이 그 레이션에 의존합니다. 견적 및 실험 도중 역동적인 변화를 받아야 수 조직 광학 매개 변수의 모델링은 일반적으로 혈액 산소의 정확한 추정이 필요합니다. 한편, 인광의 산소에 의존 담금질에 따라 산소의 부분 압력 (pO2)의 평가는 크게 조직의 광학 매개 변수의 변화에 의해 영향을 pO2의 절대 측정을 제공해서는 안됩니다. 산소에 민감한 염료를 사용하는 실험 시스템은 물론 생리 pO2 범위에서 정확한 산소 이미징 수있는 강력한 기술입니다 인광 담금질을 보여주는, 조직 문화의 산소 내용을 모니터링으로 perfused 조직의 생체내 연구에서 입증되었습니다.
여기 우리는 어떻게 인광 수명 이미징에 따라 대뇌 피질의 vasculature에 pO2 측정을 수행하는 두 개의 서로 다른 이미징 modalities과 함께 보여줍니다. 첫번째 예제에서 우리는 암흑의 대뇌 피질의 표면에 pO2의보기 영상의 다양한 분야를 제시한다. 이 영상 양상은 CCD 카메라와 레이저 펄스 녹색을 바탕으로 상대적으로 간단한 실험 설정을했습니다. Oxyphor의 R3의 염료 인광 수명에 따라 대뇌 피질의 확산 우울증을 모니터링의 예를 제시했다. 두번째 예제에서 우리는 고해상도 두 광자 마우스의 대뇌 피질 마이크로 vasculature에 pO2 이미징을 제시한다. 실험 설치 femtosecond 레이저, 전자 광학 변조기 및 광자 - 계산 사진 배율 튜브와 사용자 지정 구축 2 광자 현미경을 포함합니다. 우리는 향상된와 PTP - C343 염료 소설 2 광자 여기 크로스 섹션을 사용하여 영상의 예를 들어 모세 혈관을 포함하여 대뇌 피질의 microvasculature에 pO2 이질을 제시.
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Protocol
1. 쥐 대뇌 피질의 vasculature에 pO2의보기 영상의 다양한 분야
- 쥐 (250g -350 g)는 isoflurane과 함께 처음 anesthetized되며, 대퇴 동맥과 정맥은 심장 박동, 혈압 및 혈액 가스뿐만 아니라 정맥 주입을위한을 모니터 catheterized 있습니다. 체온은 ± 0.1 ° C.는 37 유지 기관 절개술이 수행되며, 쥐가 공기와 산소의 혼합물로 통풍이 있습니다.
- 혈액 가스를 측정하기위한 혈액 샘플마다 30-45 분 촬영하고 환기와 마취는 정상적인 생리적 범위 내에서 혈액 가스를 유지하기 위해 조정됩니다.
- 크기 정수리 뼈 4mm X 4mm의 휴일 두개골 창이 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 뼈 및 두라 제거하고 두개골 창이 1.5 % 아가로 오스 가득한과 현미경 coverslip로 밀봉합니다. 이마 뼈에 추가 1mm이 버 구멍 KCl (~ 10 μl, 1 M)의 intracortical microinjection하여 CSD를 유도하는 데 사용됩니다. 익스 트림 치료는 대뇌 피질의 vasculature의 손상을 방지하기 위해 이동해야합니다. 초과 열, 기계적 압력, 또는 hypoxia의 짧은 기간은 중간 우주에 vasculature의 혈액 뇌 장벽과 염료의 원인 누설을 손상 수 있습니다.
- 광학 불투명 소재의 마스크는 두개골 창의 주위에 배치됩니다. 마스크의 목적은 두라 사항의 가장자리에서 조직으로 유출 염색에서오고있다 인광 신호를 흡수하는 것입니다. 중간 공간에 염료는 측정을 망쳐놓 수있는 매우 밝은 인광의 원천입니다. 중간 공간에 색소의 증가 밝기가 낮은 산소 압력과 낮은 담금질 속도와 환경에서 염료의 구축의 결과입니다. 실험에 vasculature의 손상을 따라서 쉽게 실험 데이터가 거부되는 경우에는 밝고 인광 명소의 외관에 의해 인식됩니다.
- 수술 완료 후 isoflurane이 중단되고 마취는 alphachloralose (50 MG / kg 정맥 볼러스 40 MG / (kg H) 주입에 의해 다음)으로 전환됩니다.
- 동물은 환풍기, 혈압 및 온도 모니터 카트 전송됩니다. 실내 공기를 호흡하는 동안 동물은 빠르게 이미지 설정으로 이동 및 공기와 산소의 적절한 혼합으로 유량계에 reattached입니다.
- 동물을 보유하고 stereotaxic 프레임은 목적에 따라 배치됩니다. 두개골 창이 목표 아래보기의 분야에서 중심과 초점 평면에 평행하게 위치합니다.
- 펄스 레이저가 켜져 있는지 그리고 최소한의 펄스 에너지로 설정됩니다. 광학 빔은 10 개 이상의 MJ / cm 2이되고 조정됩니다 펄스 에너지 미터 및 샘플 전달 펄스 에너지쪽으로 이동합니다. ~ 60도 및 레이저 ISS의 경사 입사 각도와 두개골 창을 중심으로 빔 ISS가 비활성화.
- 동물의 생리적 매개 변수가 정상적인 생리적 범위가 될 때까지 혈액 가스 측정 및 환기 및 마취의 조정이 수행됩니다.
- 그 혈액 볼륨을 가정하면 인광 프로브 Oxyphor의 R3의 적절한 금액은 프로브 4 × 10 -5 M 혈액 농도를 달성하기위한 생리 1 ML에 용해되어 체중의 약 7 %입니다. 프로브 솔루션은 대퇴 정맥을 통해 주입합니다.
- 염화칼륨 1 M 솔루션은 준비하고 ~ 1 UL은 CSD를 유도하기 위해 이마 뼈에 버 구멍 주사기로 주입됩니다.
- 레이저가 켜져 및 이미징 즉시 KCl 용액의 주입 후에 시작됩니다. 인광의 이미징은 ~ 10 분 동안 수행됩니다.
- 또 혈액 가스 측정 동물 생리학 매개 변수가 정상 범위 내에 아직도 확인이 수행됩니다.
- 인광 수명은 Matlab의 통계 가중치와 비선형 평방 피팅을 사용하여 하나의 지수 부패를 피팅하여 모든 픽셀에 대해 얻을 수 있습니다. 인광 수명은 경험적 스턴 볼머 같은 관계 (보라 인프라)를 사용하여 pO2 값으로 변환됩니다.
2. 고해상도 두 광자 마우스의 대뇌 피질 마이크로 vasculature에 pO2 이미징
- isofluorene과 대퇴 동맥은 심장 박동, 혈압 및 혈액 가스뿐만 아니라 염료의 관리를위한로 모니터 catheterized이다와 마우스는 anesthetized 있습니다. 체온이 37 유지 ± 0.1 ° C와 동물들이 자발적으로 공기와 산소의 혼합물을 호흡하고 있습니다.
- 두개골 창이 원래 데이비드 Kleinfeld 및 Winfried Denk 개발한 기술에 따라 준비가되어 있습니다. 좋은주의 중간 공간으로 염색 가능한 누출을 방지하기 위해 vasculature의 손상을 방지하기 위해 이동해야합니다.
- 혈액 가스를 측정하기위한 몇 가지 혈액 샘플은 모든 준비 절차 동안 촬영하고 환기 및 마취가 혈액 가스를 유지하기 위해 조정됩니다정상적인 생리적 범위 말이지.
- 동물은 이미지 설정으로 이동됩니다. 동물을 보유하고 수정 stereotaxic 프레임은 목적에 따라 배치됩니다. 두개골 창이 올림푸스 4X 목표 아래보기의 분야에서 중심과 초점 평면에 평행하게 위치합니다.
- 두개골 윈도우의 이미지가 eyepieces를 통해 디지털 카메라로 촬영한이며, 4X 목적은 올림푸스 20X 목표 (NA는 = 0.95)로 대체됩니다.
- 동물의 생리적 매개 변수가 정상적인 생리적 범위까지 혈액 가스 측정 및 환기 및 마취의 조정이 수행됩니다.
- 그 혈액 볼륨을 가정하면 체중의 약 7 %, 인광 프로브 PTP - C343의 적절한 금액 탐사선 ~ 15 μm의 혈액 농도를 달성하기 위해 호수의 0.2 ML에 녹아입니다. 프로브 솔루션은 대퇴 동맥을 통해 주입합니다.
- 각 픽셀에 염료 여기 및 방출 수집 원하는 시간 간격을 설정하여 실험을 시작합니다.
- 현재 깊이에서 vasculature 구조를 표시 인광 강도 부패의 속도가 느린 2 차원 래스터 스캔하는 조사 검사를 수집. 목적은 두개골 창에 수직 이동 (Z 축)과 인광 강도의 느린 2D 조사 스캔은 이미지 비행기에서 microvessels를 찾을 수 840 nm의에서 최소한의 레이저 파워를 사용하여 촬영하고 있습니다.
- 그 깊이에 인광의 조사 검사를 기반으로 각각의 이미지 깊이에서, vasculature 이내에 포인트의 집합이 선택되며, 각각의 시점에서 인광 자연 붕괴의 기록은 평균의 미리 정의된 번호를 반복됩니다.
- 원하는 평균 금액, 측정 간격, 그리고 실험 기간을 설정하고 측정을 시작합니다. PO 2 측정은 실험 기간 동안 지정된 측정 간격 선택한 위치에서 찾았습니다.
- 측정하는 동안, 소프트웨어는 검류계 검사 거울의 위치를 변경하여 선택한 위치에 여기 레이저를 다시 연결해줍니다. 검류계 스캐너, 전자 광학 변조기 및 기타 모든 장비의 제어는 LabView에서 맞춤 제작한 소프트웨어에 의해 수행됩니다.
- 인광 수명은 Matlab의 비선형 평방 피팅을 사용하여 하나의 지수 부패를 피팅하여 선택한 모든 지점에 대해 얻을 수 있습니다. 인광 수명은 경험적 스턴 볼머 같은 관계 (보라 인프라)를 사용하여 pO2 값으로 변환됩니다.
- 다양한 피질 깊이에서 데이터를 수집 후, 영상 microvasculature 구조 vasculature에 dextran - 복합 플루오레신 염료를 주입.
- 4 채널 검출기에 녹색 채널을 사용하는 FITC 형광 반응의 두 광자 이미징을 수행하여 vasculature의 구조 이미지의 스택을 얻습니다.
- 동물 실험 연구 애니멀 케어에 매사 추세츠 종합 병원 분과에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
3. 대표 결과 :
이 그림의 왼쪽에있는 그림 1. 패널 (A)는 CSD 파의 도착 전에 산소 압력보기 이미지의 다양한 필드를 표시합니다. 오른쪽에있는 패널 (B)는 패널에 표시된 관심있는 지역 내의 CSD 전파 동안 평균 산소 압력의 시간적 진화 (A)를 보여줍니다.
그림 2 (AVI 동영상) :이 영화는 CSD 파의 전파하는 동안 전체 두개골 윈도우의 산소 압력의 시간적 변화를 보여줍니다. 스케일 바 수은 밀리미터 산소 압력을 나타냅니다.
그림 3. 몇 군데 vasculature 스택의 3D 투영. 회색의 음영은 판매량 선박 마스크를 나타내는 구조 이미지를 기반으로 만들었습니다. 측정 PO 2 값을 색으로 표시됩니다. 스케일 바는 200 micrometers입니다. 자연 출판 그룹의 허가 Reprinted 7.
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Discussion
우리는 인광의 산소에 의존 담금질에 따라 대뇌 피질의 microvasculature의 pO2 측정의 두 어플 리케이션을 시연했다. CCD 이미징에 따라 첫 번째 방법은 2 광자 현미경을 기반으로 대뇌 피질의 microvasculature에서 산소의 부분 압력을 측정, pO2의 전망 모니터링의 다양한 분야를 제공하고 있지만 모세 해상도를 제공하고 깊이 이미징 수 있습니다. 두 가지 방법은 높은 속도와 높은 신호 대 잡음 측정을 제공합니다. 또한, pO2의 인광 수명 측정은 일반적으로 강도에 따라 대비 메커니즘을 가지고 다른 광학 이미징 기술에 대한 우려는 실험 기간 동안 조직의 광학 매개 변수의 변화에 크게 구분하지 않습니다. 제시 악기 양적 산소의 동적 전달의 분석 및 정상과 질병 두뇌에 neurovascular 커플링의 더 나은 이해로 이어질 것입니다 뇌 조직 신진 대사를 허용
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Acknowledgments
우리는 건강 보조금 R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 및 R01EB007279와 미국 심장 협회 부여 0855772D 미국 국립 연구소의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
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