Summary
我们提出了一个基于磷光氧依赖淬火脑血管的氧分压（PO2）测量的实验过程。动物准备和成像过程概述了两个大的领域的观点基于CCD成像PO2在大鼠和双光子激发的小鼠PO2成像。
Abstract
监测脑血流和组织氧合的时空特征是为更好地理解代谢的神经血管的关系是至关重要的。新氧分压PO2同步监测的角度较大的领域，具有较高的空间和/或时间分辨率的测量方式的发展将使到正常的大脑的运作有更深的了解，也将产生重大影响，如神经血管疾病的诊断和治疗中风，阿尔茨海默氏症，和头部受伤。
光学成像方式，都表现出很大的潜力，提供高时空分辨率和PO2定量成像，在可见光和近红外光谱范围内的血红蛋白吸收的基础上。然而，多光谱测量脑血氧依赖通过高散射脑组织中光子迁移。组织光学参数，在实验过程中可能发生的动态变化的估计和建模，通常需要为准确估计血氧。另一方面，估计的氧分压（PO2）基于磷光氧依赖淬火应不显着影响，在组织光学参数的变化，并提供了一个绝对的PO2措施。利用氧敏感染料的实验系统已被证明在体内灌注组织的研究以及监测在组织培养中的氧气含量，表明磷光淬火是一个强有力的技术，能够准确的氧气成像PO2在生理范围。
在这里，我们展示了两种不同的成像方式如何执行上的磷光寿命成像的皮层血管PO2测量。在第一个示范，我们目前在老鼠的皮质表面的角度宽视场成像PO2。这种成像方式比较简单的实验装置，基于CCD相机和一个脉冲的绿色激光。监测的皮层扩散性抑制，基于Oxyphor R3的染料的磷光寿命的一个例子。在第二个演示中，我们提出了一个高分辨率的双光子PO2在皮质鼠标的微型血管成像。实验装置包括一个定制的双光子显微镜，飞秒激光，电光调制器，光子计数光电倍增管。我们目前的成像例如皮质微血管包括毛细血管氧分压异质性，使用新型具有增强PTP - C343染料的双光子激发截面。
点击这里查看相关文章的合成与氧在生物系统成像的磷光纳米探针的校准。
Protocol
1。宽视场成像PO2查看老鼠的皮质血管
- 最初麻醉与异氟醚组（250克-350克），股动脉和静脉插管监测心率，血压，血气，以及静脉滴注。体温保持在37 ± 0.1 ° C。进行气管切开术，大鼠和通风与空气和氧气的混合物。
- 用于测量血液气体的血液样本每次30-45分钟，通风和麻醉的调整，以保持正常的生理范围内的血气。
- 颅顶骨4毫米x 4毫米大小的窗口，是一个封闭的准备成像。骨和硬脑膜和颅窗口充满了1.5％琼脂糖，密封，用显微镜的盖玻片。 1毫米2毛刺额骨上的孔是用来诱导intracortical显微注射氯化钾（〜10μL，1米）惩教署。应采取特别小心，以避免任何损害的皮质血管。多余的热量，机械压力，或缺氧的短暂时期，可能会危及从血管进入间质空间血脑屏障的染料，并导致泄漏。
- 从光学不透明材料的面具是周围放置颅窗口。面膜的目的是吸收磷光信号，从泄露组织的染料，从硬脑膜问题边缘未来。染料的间隙是非常明亮的磷光，可以破坏测量的来源。间质空间中的染料的亮度增加，是导致低氧分压和猝灭速率低的环境中建立的染料。实验血管的损伤，因此容易识别的外观明亮的磷光点，在这种情况下的实验数据将被拒绝。
- 手术完成后，异氟醚停止麻醉切换到alphachloralose（50毫克/公斤静脉注射40毫克/（千克H）输液）。
- 动物转移上车，呼吸，血压和体温监测。动物呼吸室内空气的同时，迅速转移到成像设置适当的空气和氧气的混合物，并重新连接流量计。
- 持有的动物脑立体定位框架，是摆下的目标。颅窗口集中在视野下的目标和定位焦平面平行。
- 脉冲激光开启，并设置为最小的脉冲能量。脉冲电能表和脉冲能量传递到样品的激光束指向调整为不超过10兆焦耳/ 厘米 2 。束与斜入射角度〜60度和激光ISS国际空间站上的颅窗口为本关闭。
- 血液通风和麻醉气体测量和调整执行，直到所有的动物生理参数正常生理范围内。
- 假设血容量是体重约7％，达到4 × 10 -5米的探头血药浓度的1毫升生理盐水溶解适量的磷光探针Oxyphor R3 。探头解决方案是通过股静脉注射。
- 一个1米氯化钾解决方案的编制和〜1 UL是通过额骨上的毛刺小孔，用注射器注入诱导惩教署。
- 打开激光成像KCl溶液注射后立即开始。磷光成像是在〜10分钟。
- 另一种血液中的气体进行测量，以确认动物生理参数仍然在正常范围内。
- 磷光寿命得到所有的像素，通过拟合单指数衰减，使用Matlab中的统计加权非线性平方米装修。磷光寿命转换为使用一个实证斯特恩Volmer关系（见下文）的PO2值。
2。高分辨率双光子PO2在皮质鼠标的微型血管成像
- 小鼠麻醉isofluorene和股动脉插管监测心率，血压，血气，以及染料的管理。体温保持在37 ± 0.1 ° C和动物自主呼吸的空气和氧气的混合物。
- 颅窗口是根据最初是由大卫柯菲德和温弗里德Denk开发的技术准备。应采取一个良好的护理，以避免任何损害血管间质空间，防止可能泄漏的染料。
- 在整个筹备过程和一个用于测量血液中气体的少量血液样本采取通风和麻醉的调整，以保持血气ES在正常生理范围。
- 动物移动到成像装置。一个修改后的立体框架，认为动物是摆下的目标。颅窗口集中在视野下的奥林巴斯4X目标和定位焦平面平行。
- 颅窗口的图像与数码相机通过目镜，4X的目标是与奥林巴斯20X物镜（NA = 0.95）所取代。
- 血液通风和麻醉气体测量和调整，直到所有的动物生理参数，是一种正常的生理范围内执行。
- 假设血液量的约7％的体重，适量的磷光探针PTP - C343是0.2毫升生理盐水达到〜15微米的探针的血药浓度溶解。探头解决方案是经股动脉注射。
- 开始实验，通过设置在每个像素的排放染料激发和收集所需的时间间隔。
- 取得的一项调查显示扫描，这是一个缓慢的二维光栅扫描显示在当前深入的血管结构的磷光强度衰减。目的是颅窗口垂直移动（Z轴）和磷光强度缓慢2D调查扫描使用840纳米的最小激光功率，发现在成像平面上的微血管。
- 在每个成像深度，在这个深度，基于磷光调查扫描，血管内的点被选中，并记录在每个点上的磷光衰减的平均预定的号码重复。
- 设置所需的平均量，测量时间间隔，和实验的持续时间，并开始测量。在实验期间，PO 2测量是在选定的地点在指定的测量间隔收购。
- 在测量过程中，该软件重新激发激光指示选定的地点，通过改变振镜扫描镜的位置。控制振镜扫描仪，光电调制器，和所有其他的设备进行定制LabVIEW软件。
- 磷光寿命得到所有选中的点，通过拟合单指数衰减，使用Matlab中的非线性平方米装修。磷光寿命转换为使用一个实证斯特恩Volmer关系（见下文）的PO2值。
- 收集各种皮层深处的数据后，注入血管成像微血管结构右旋糖酐标记的荧光染料。
- 执行FITC荧光双光子成像，使用绿色通道，四通道探测器获取血管的结构图像的堆栈。
- 动物实验是由美国马萨诸塞州总医院研究动物保健小组委员会提出的准则和法规的规定执行。
3。代表性的成果：
图1（一）对这个数字的左侧面板显示惩教署波到来前查看形象氧气压力的一个广泛的领域。 （b）显示面板右侧平均氧气压力随时间的演化（一）在惩教署面板上标记的利益区域内传播。
图2（AVI电影）：这部电影显示惩教署波的传播过程中的氧气压力在整个颅窗口的时间演化。比例尺表示氧气毫米汞柱的压力。
图3。3D投影成像血管堆栈。灰色色调代表一个体积容器面具，创建的基础上的结构图像。 2 PO测量的值是颜色编码。比例尺为200微米。自然出版集团的许可重印 7 。
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Discussion
我们证明了两个PO2皮质微血管的基础上磷光氧依赖淬火的测量应用。虽然基于CCD成像的第一种方法提供广泛的领域观点氧分压监测，测量皮质微血管的氧气分压双光子显微镜的基础上提供了毛细血管的决议，并允许在深度成像。这两种方法提供高速度和高信号噪声的测量。此外，PO2磷光寿命测量主要是在实验过程中，这通常是其他光学成像技术，有一个对比机制的基础上强度的关注，在组织光学参数的变化不敏感。主办仪器允许动态交付的氧气和脑组织的新陈代谢，这将导致更好地了解在正常和病变脑的神经血管耦合的定量分析
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Acknowledgments
我们要感谢美国国家卫生赠款R01NS057476，P50NS010828，P01NS055104，R01EB000790，K99NS067050，R01HL081273和R01EB007279和美国心脏协会授予0855772D研究院的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
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