Summary
我々は、燐光の酸素依存性消光に基づく脳血管系における酸素の分圧（PO2）を測定するための実験手順を示す。動物の準備と撮像法は、ラットとマウスにおけるPO2の2光子励起に基づくイメージングにおけるPO2のビューCCDベースのイメージングの大きなフィールドの両方に概説された。
Abstract
脳血と組織の酸素化の時空間特性のモニタリングは、神経代謝、血管の関係をより良く理解するために重要です。高い空間および/または時間分解能を持つビューの大きなフィールドでPO2の同時モニタリングを持つ新しいPO2測定のモダリティの発展は、正常な脳の働きにより深い洞察を可能にし、次のような神経血管疾患の診断と治療に大きな影響を与えることになるも脳卒中、アルツハイマー病、および頭部外傷。
光学的画像診断法は、光スペクトルの可視および近赤外領域でのヘモグロビンの吸収に基づいて、高時空間分解能とPO2の定量的なイメージングを提供する大きな可能性を示している。しかし、脳の血液の酸素化のマルチスペクトル測定は、高度に散乱脳組織を介して光子の移行に依存しています。実験中の動的な変更を受けることができる組織の光学パラメータ、、の推定とモデリングは通常、血液の酸素化の正確な推定が必要です。一方、燐光の酸素依存性消光に基づく酸素の分圧（PO2）の推定は大幅に組織の光学的パラメータの変化の影響を受け、PO2の絶対的な尺度を提供すべきではない。酸素感受性色素を利用した実験系は、同様に生理的PO2範囲の正確な酸素の撮影が可能な強力な技術であること燐光消光を示し、組織培養中の酸素含有量を監視するためとして、潅流組織のin vivo試験で実証されている。
ここでは、どのように燐光寿命イメージングに基づいて、皮質血管系にPO2の測定を行うために二つの異なる画像診断法を示しています。最初のデモンストレーションでは、ラットの皮質表面でPO2のビューイメージングの幅広い分野を提示。この画像診断法は、CCDカメラおよびパルスグリーンレーザーに基づいて比較的単純な実験のセットアップを持っています。 Oxyphor R3染料の燐光寿命に基づいて、皮質拡散うつ病を監視の例が発表された。第二デモンストレーションでは、マウスの皮質微小血管系の高分解能二光子PO2のイメージングを示す。実験は、フェムト秒レーザー、電気光学変調器、およびフォトンカウンティング光電子増倍管を備えたカスタム構築された2光子顕微鏡を含みます。我々は、強化されたとPTP - C343色素小説2光子励起の断面積を用いて、イメージングの例毛細血管を含む皮質微小血管系におけるPO2異質性を提示する。
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Protocol
1。ラットの皮質血管系におけるPO2のビューイメージングの幅広い分野
- ラット（250グラム-350 g）は、最初はイソフルランで麻酔し、大腿動脈と静脈は、心拍数、血圧、および血液ガスだけでなく、点滴静注用を監視するためにカテーテルをされています。体温は、± 0.1 37℃に維持され気管切開が行われ、ラットは、空気と酸素の混合物で換気されています。
- 血液ガスを測定するための血液サンプルは、すべて30〜45分を取られて、換気や麻酔は通常の生理的範囲内で血液ガスを保つために調整されます。
- サイズの頭頂骨4ミリメートル× 4mmの上に閉じた頭蓋窓は、イメージングのために用意されています。骨と硬膜が除去され、頭蓋窓は1.5％アガロースを充填し、顕微鏡のカバーガラスで封止されている。前頭骨上に追加の1 MM 2バリ穴は、KClの皮質内マイクロインジェクション（〜10μlの1 M）でCSDを誘導するために使用されます。細心の注意が皮質血管系の損傷を避けるために注意すべきである。余分な熱、機械的な圧力、または低酸素症の短い期間では、血液脳関門を危うくし、間隙に血管から染料の漏れの原因となります。
- 光学的に不透明な材料からマスクが頭蓋窓の周囲に配置されます。マスクの目的は、硬膜の端から組織への漏出色素から来ているりん光信号を吸収することです。間隙空間内の色素が測定を台無しにすることができます非常に明るい燐光の源です。間隙空間における色素の増加明るさは、低酸素圧と低消光速度と環境に色素の蓄積の結果です。実験では血管系の損傷は、したがって、容易に実験データが拒否される場合には明るい燐光スポット、の出現で認識されます。
- 手術終了後、イソフルランは廃止され、麻酔がalphachloralose（40 mgの/量（kg h）の注入に続いて50 mg / kgの静脈内ボーラス）に切り替えられます。
- 動物は人工呼吸器、血圧と温度モニター付きカートで転送されます。部屋の空気を呼吸しながら、動物はすぐに、イメージングセットアップに移動し、空気と酸素の適切な混合物で流量計に再接続されます。
- 動物を保持する定位固定フレームは、客観的の下に配置されます。頭蓋窓は、客観的で視野の中央に配置し、焦点面に平行に配置されている。
- パルスレーザーの電源が入っていて、最小限のパルスエネルギーに設定されています。光ビームは、10以上のミリジュール/ cm 2ではなくなるように調整されたパルスのエネルギーメーターとサンプルに配信パルスのエネルギーに向けられている。ビームISSは、〜60度の斜入射角と頭蓋窓を中心とレーザーISSがオフになって。
- 動物のすべての生理学的パラメータは正常な生理的範囲内になるまで血液ガスの測定値と換気と麻酔の調整が行われている。
- その血液量を仮定すると燐光プローブOxyphor R3の適切な量のプローブの4 × 10 -5 Mの血中濃度を達成するために生理食塩水1 mLに溶解させ、体重の約7％です。プローブ溶液は大腿静脈を介して注入される。
- 塩化カリウムの1M溶液を調製し、約1 ULは、CSDを誘導する前頭骨上バリ穴から注射器で注入されます。
- レーザーがオンになっていると画像はすぐにKCl溶液の注入後に開始されます。リン光のイメージングは、〜10分中に実行されます。
- 別の血液ガスの測定は、動物の生理学的パラメータが正常範囲内に残っていることを確認するために実行されます。
- リン光寿命は、Matlabの統計的重み付き非線形正方形のフィッティングを使用して単一の指数関数的減衰をフィッティングすることにより全ての画素に対して得られる。リン光寿命は経験的スターンボルマーのような関係を（下記参照）を使用してPO2値に変換されます。
2。マウスの皮質微小血管系の高分解能二光子PO2イメージング
- isofluoreneと大腿動脈が心拍数、血圧、および血液ガスだけでなく、色素を投与するために監視するためにカテーテルを挿入されているとマウスを麻酔しています。体温が37℃に維持される± 0.1℃と動物が自発的に空気と酸素の混合物を呼吸している。
- 頭蓋窓は当初、David Kleinfeldとヴィンフリートデンクによって開発された技術に従って調製される。良いケアは、間隙に色素の漏れを防ぐために血管系の損傷を避けるために注意すべきである。
- 血液ガスを測定するためのいくつかの血液サンプルは、製剤全体の手順の間に取られており、換気や麻酔が血液ガスを保つように調整されています正常な生理的範囲内にES。
- 動物は、イメージングセットアップに移動されます。動物を保持している変更定位フレームが目的の下に配置されます。頭蓋窓はオリンパス4X目的の下、視野の中央に配置し、焦点面に平行に配置されている。
- 頭蓋窓の画像は、接眼レンズを介してデジタルカメラで撮影され、そして4X目的はオリンパス20倍対物レンズ（NA = 0.95）に置き換えられます。
- 動物のすべての生理学的パラメータは正常な生理的範囲内になるまで血液ガスの測定値と換気と麻酔の調整が行われている。
- その血液量を仮定すると、体重の約7％、燐光プローブPTP - C343の適切な量のプローブの〜15μMの血中濃度を達成するために生理食塩水0.2 mLに溶解されています。プローブ溶液は大腿動脈を介して注入される。
- 各ピクセルでの色素励起と発光の収集のために必要な時間間隔を設定することにより、実験を始める。
- 現在の深さで血管構造を表示するリン光強度の減衰の遅い2次元ラスタースキャンである調査のスキャンを取得する。目的は、頭蓋窓に垂直に移動されます（Z軸）とリン光強度の遅い2D調査のスキャンは、結像面での微小血管を見つけるために840 nmで最小のレーザパワーを用いて撮影されています。
- その深さで燐光の調査のスキャンに基づいて各画像の深さ、で、血管系内の点の集合が選択され、各点でのリン光減衰の記録は、平均の定義済みの数のために繰り返されます。
- 希望する平均の量、測定間隔、およびテスト期間を設定し、測定を開始します。 PO 2の測定は、実験期間中に指定された測定間隔で、選択した場所に取得されます。
- 測定中に、ソフトウェアは、ガルバノスキャンミラーの位置を変更することにより、選択した場所に励起レーザーを再指示する。ガルバノメータスキャナ、電気光学変調器、およびその他すべての機器の制御は、LabVIEWでカスタムメイドのソフトウェアによって実行されます。
- リン光寿命は、Matlabの非線形正方形のフィッティングを使用して単一の指数関数的減衰をフィッティングすることにより、選択したすべてのポイントで得られる。リン光寿命は経験的スターンボルマーのような関係を（下記参照）を使用してPO2値に変換されます。
- 様々な皮質の深さでデータを収集した後、イメージングのための血管に微小血管構造のデキストランコンジュゲートフルオレセイン色素を注入する。
- 4チャンネルの検出器の緑のチャネルを使用してFITC蛍光の二光子励起イメージングを行うことにより、血管系の構造的な画像のスタックを取得する。
- 動物実験は研究のアニマルケアのマサチューセッツ総合病院の小委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
3。代表的な結果：
この図の左側の図1。パネル（）CSDの波の到着前に酸素の圧力のビューの画像の幅広いフィールドが表示されます。 （b）の右側のパネルは、パネル（）にマーク関心領域内のCSDの伝播中の平均酸素圧の時間変化を示しています。
図2（AVI動画）：この映画は、CSDの波の伝播中に、全体頭蓋窓の酸素圧の時間変化を示しています。スケールバーは水銀のミリメートル単位での酸素圧力を示します。
図3。撮像された血管系のスタックの3次元投影。グレーの影は、容積血管のマスクを表す構造的な画像に基づいて作成。測定されたPO 2値は色分けされています。スケールバーは200マイクロメートルである。ネイチャーパブリッシンググループから許可を得て転載。7
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Discussion
我々は、燐光の酸素依存性消光に基づく皮質微小血管系におけるPO2測定の2つのアプリケーションを示した。 CCDイメージングに基づいて、最初の方法は、2光子顕微鏡に基づいて、皮質の微小血管系における酸素の分圧を測定し、PO2のビューの監視の幅広いフィールドを提供する一方で毛細血管の分解能を提供し、深さで撮影することができます。どちらの方法では、高速および高信号対雑音の測定を提供します。さらに、PO2のりん光寿命の測定は、通常の強度に基づいてコントラストのメカニズムを持っている他の光学イメージング技術のための関心事である実験、中の組織の光学的パラメータの変化に大きく小文字を区別しません。発表機器は正常と病的脳における神経血管結合のより良い理解につながると酸素と脳組織の代謝の動的な配信の定量分析を可能にする
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Acknowledgments
我々は、健康補助R01NS057476、P50NS010828、P01NS055104、R01EB000790、K99NS067050、R01HL081273とR01EB007279とアメリカ心臓協会の助成金0855772Dの米国国立研究所からの支援に感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
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