Summary
We presenteren een experimentele procedure voor het meten van de partiële druk van zuurstof (pO2) in cerebrale vaatstelsel op basis van zuurstof-afhankelijke quenching van fosforescentie. Dier voorbereiding en beeldvormende procedures werden uiteengezet voor zowel grote beeldveld van CCD-gebaseerde beeldvorming van pO2 in ratten en twee-foton excitatie gebaseerde beeldvorming van de pO2 in muizen.
Abstract
Monitoring van de spatio-temporele karakteristieken van de cerebrale bloed en weefsel oxygenatie is cruciaal voor een beter begrip van de neuro-metabole-vasculaire relatie. Ontwikkeling van nieuwe pO2 meting modaliteiten met gelijktijdige controle van de pO2 in grotere gebied van beeld met een hogere ruimtelijke en / of temporele resolutie in staat zal stellen meer inzicht in de werking van het normale hersenen en zal ook een aanzienlijke impact op de diagnose en behandeling van neurovasculaire ziekten, zoals beroerte, ziekte van Alzheimer, en hoofdletsel.
Optische beeldvorming modaliteiten hebben aangetoond een groot potentieel om een hoge resolutie en spatiotemporele Quantitative Imaging van de pO2 op basis van hemoglobine absorptie in zichtbare en nabij-infrarode bereik van optische spectrum te bieden. Echter, multispectrale meting van de cerebrale bloedoxygenatie vertrouwt op foton migratie door de zeer verstrooiing hersenweefsel. Schatting en modellering van weefsel optische parameters, die kan ondergaan dynamische veranderingen tijdens het experiment, is meestal vereist voor nauwkeurige schatting van het bloed zuurstof. Aan de andere kant moet de schatting van de partiële druk van zuurstof (pO2) op basis van zuurstof-afhankelijke quenching van fosforescentie niet significant worden beïnvloed door de veranderingen in de optische parameters van het weefsel en zorgt voor een absolute maatstaf is van pO2. Experimentele systemen die zuurstof-gevoelige kleurstoffen te gebruiken zijn aangetoond in in vivo studies van de geperfuseerde weefsel als voor het toezicht op het zuurstofgehalte in het weefsel culturen, waaruit blijkt dat fosforescentie afschrikken is een krachtige techniek die in staat van nauwkeurige zuurstof beeldvorming in de fysiologische pO2 bereik.
Hier laten we zien met twee verschillende beeldvormende modaliteiten hoe de meting van de pO2 te voeren in de corticale vasculatuur op basis van fosforescentie lifetime imaging. In de eerste demonstratie presenteren wij breed gezichtsveld beeldvorming van pO2 in de corticale oppervlak van een rat. Dit beeldvormende modaliteit heeft relatief eenvoudige experimentele opstelling op basis van een CCD-camera en een gepulseerd groene laser. Een voorbeeld van het toezicht op de corticale het verspreiden van een depressie op basis van fosforescentie levensduur van Oxyphor R3 kleurstof werd gepresenteerd. In de tweede demonstratie presenteren wij een hoge resolutie twee-foton pO2 beeldvorming in corticale micro-vaatstelsel van een muis. De experimentele opstelling bestaat uit een op maat gemaakte twee-foton microscoop met femtoseconde laser, elektro-optische modulator, en foton-tellen van foto multiplier buis. We presenteren een voorbeeld van beeldvorming van de pO2 heterogeniteit in de corticale microvasculatuur waaronder haarvaten, met behulp van een nieuwe PtP-C343 kleurstof met verbeterde twee-foton excitatie doorsnede.
Klik hier om het bijbehorende artikel wordt weergegeven Synthese en kalibratie van Phosphorescent nanosondes voor zuurstof Imaging in Biological Systems.
Protocol
1. Breed gezichtsveld beeldvorming van de pO2 in corticale vaatstelsel van een rat
- Ratten (250 g -350 g) worden initieel verdoofd met isofluraan, en de femorale slagader en ader worden gecatheteriseerd de hartslag, bloeddruk en bloed gassen, evenals voor intraveneuze infusie te controleren. Lichaamstemperatuur is gehandhaafd op 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomie wordt uitgevoerd, en ratten worden geventileerd met een mengsel van lucht en zuurstof.
- Bloedmonsters voor het meten van de bloedgassen worden elke 30-45 min en de ventilatie en de anesthesie zijn aangepast aan de bloedgassen te houden binnen de normale fysiologische bereik.
- Een gesloten craniale venster op de pariëtale been 4 mm x 4 mm groot is voorbereid voor de beeldvorming. Het bot en dura worden verwijderd en de craniale venster is gevuld met 1,5% agarose en verzegeld met een microscoop dekglaasje aan. Een extra 1 mm 2 braam gat op de frontale bot wordt gebruikt om de CSD te induceren door intracorticale micro-injectie van KCl (~ 10 ui, 1 M). Uiterst voorzichtig moeten worden genomen om schade van de corticale vaatstelsel te voorkomen. Overtollige warmte, mechanische druk of korte periode van hypoxie in gevaar kan brengen bloed-hersen barrière en veroorzaken lekkage van de kleurstof van het vaatstelsel in de interstitiële ruimte.
- Een masker van optisch ondoorzichtig materiaal is geplaatst rond craniale venster. Het doel van het masker is te absorberen fosforescentie signaal dat afkomstig is van de kleurstof die in het weefsel gelekt uit de randen van de dura materie. De kleurstof in de interstitiële ruimte is de bron van de zeer heldere fosforescentie dat de meting kan bederven. De verhoogde helderheid van de kleurstof in interstitiële ruimte is het resultaat van opbouw van de kleurstof in de omgeving met een lage zuurstofdruk en een lage afschrikken tarief. De schade van de bloedvaten in experiment is dus gemakkelijk te herkennen aan het uiterlijk van heldere fosforescentie vlekken, in welk geval de experimentele data wordt afgewezen.
- Na voltooiing van de operatie, is isofluraan gestaakt en anesthesie is overgeschakeld naar alphachloralose (50 mg / kg intraveneuze bolus, gevolgd door 40 mg / (kg h) infusie).
- Dier wordt overgebracht op een kar met ventilator, bloeddruk en temperatuur te controleren. Terwijl het ademen van de omgevingslucht, wordt het dier al snel verplaatst naar de beeldvorming installatie en opnieuw aan de flowmeter met de juiste mengsel van lucht en zuurstof.
- De stereotaxisch kader dat het dier houdt is geplaatst onder de doelstelling. Het craniale venster is in het midden van het beeldveld in het doel en evenwijdig aan het brandvlak.
- De gepulste laser is ingeschakeld en ingesteld op een minimale hartslag energie. De optische beam is gericht op pulsenergie meter en puls energie geleverd aan het monster wordt aangepast om niet meer dan 10 mJ / cm 2. De bundel iss gericht op de schedel raam met schuine invalshoek van ~ 60 graden en laser iss uitgeschakeld.
- Bloed gas metingen en aanpassingen van de ventilatie en de verdoving worden uitgevoerd totdat alle fysiologische parameters van het dier waren binnen de normale fysiologische bereik.
- Ervan uitgaande dat het bloedvolume is ongeveer 7% van het lichaamsgewicht, een geschikte hoeveelheid van de fosforescentie sonde Oxyphor R3 wordt opgelost in 1 ml zoutoplossing om 4 x 10 -5 M bloed de concentratie van de sonde te bereiken. De probe-oplossing wordt geïnjecteerd via de lies.
- Een 1 M oplossing van kalium-chloride wordt bereid en ~ 1 ul wordt ingespoten met de spuit via de braam gat in de frontale bot CSD induceren.
- De laser is ingeschakeld en beeldvorming wordt gestart direct na de injectie van de KCl oplossing. Beeldvorming van fosforescentie wordt uitgevoerd tijdens de ~ 10 minuten.
- Een ander bloed gas meting wordt uitgevoerd om te bevestigen dat de dierlijke fysiologische parameters nog steeds binnen het normale bereik.
- Fosforescentie levens worden verkregen voor alle pixels door het aanbrengen van de single exponentieel verval met behulp van niet-lineaire vierkante fitting met statistische weging in Matlab. Fosforescentie levens worden omgerekend naar de pO2 waarden met behulp van een empirisch Stern Volmer-achtige relatie (vide infra).
2. Hoge resolutie twee-foton pO2 beeldvorming in corticale micro-vaatstelsel van een muis
- Muizen worden verdoofd met isofluorene en femorale slagader is gecatheteriseerd de hartslag, bloeddruk en bloed gassen, evenals voor de toediening van de kleurstof monitor. Lichaamstemperatuur is gehandhaafd op 37 ± 0,1 ° C en dieren zijn spontaan ademen een mengsel van lucht en zuurstof.
- Een craniale venster is bereid volgens techniek die oorspronkelijk ontwikkeld door David Kleinfeld en Winfried Denk. Een goede zorg moeten worden genomen om eventuele schade aan de bloedvaten om eventuele lekkage van de kleurstof te voorkomen dat in de interstitiële ruimte.
- Een aantal bloedmonsters voor het meten van de bloedgassen zijn genomen tijdens een hele voorbereiding procedure en ventilatie en anesthesie worden aangepast aan het bloed gas te houdenes binnen de normale fysiologische bereik.
- Het dier wordt verplaatst naar de beeldvorming te stellen. Een aangepaste stereotaxisch kader dat het dier houdt is geplaatst onder de doelstelling. Het craniale venster is in het midden van het gezichtsveld onder de Olympus 4X doel en evenwijdig aan het brandvlak.
- Een afbeelding van de craniale venster wordt genomen met de digitale camera door de oculairs, en de 4x doel is vervangen door de Olympus 20X objectief (NA = 0,95).
- Bloed gas metingen en aanpassingen van de ventilatie en de verdoving worden uitgevoerd totdat alle fysiologische parameters van het dier binnen een normale fysiologische bereik.
- Ervan uitgaande dat het bloedvolume is ongeveer 7% van het lichaamsgewicht, een geschikte hoeveelheid van de fosforescentie probe PtP-C343 wordt opgelost in 0,2 ml van een zoutoplossing tot ~ 15 uM bloedconcentratie van de sonde te bereiken. De probe-oplossing wordt geïnjecteerd via de arteria femoralis.
- Begin het experiment door het instellen van de gewenste tijdsintervallen voor dye excitatie en emissie collectie op elke pixel.
- Het verwerven van een survey-scan, die is een traag 2-dimensionale raster scan van fosforescentie intensiteit verval dat de bloedvaten structuur op de huidige diepte wordt weergegeven. Het doel is loodrecht verplaatst naar de craniale venster (Z-as) en langzaam 2D overzicht scans van fosforescentie intensiteit worden genomen met de minimale laser vermogen bij 840 nm op de bloedvaten te vinden in de beeldvorming vliegtuig.
- Bij elke imaging diepte, op basis van het onderzoek scan van fosforescentie op die diepte, zijn een reeks van punten in het vatenstelsel geselecteerd, en het opnemen van fosforescentie vervalt op elk punt wordt herhaald voor een vooraf bepaald aantal gemiddeld.
- Stel de gewenste hoeveelheid van middelen, meetinterval en de duur van het experiment en start de meting. pO 2 metingen zijn verworven op de geselecteerde locaties op de gespecificeerde meetinterval voor de duur van het experiment.
- Tijdens de metingen, de software opnieuw stuurt de excitatie laser om de geselecteerde locaties door het veranderen van de positie van de galvanometer scannen spiegels. Controle van de galvanometer scanners, elektro-optische modulator, en alle andere apparatuur worden uitgevoerd door maatwerk software in LabView.
- Fosforescentie levens worden verkregen voor alle geselecteerde punten door het aanbrengen van de single exponentieel verval met behulp van niet-lineaire vierkante fitting in Matlab. Fosforescentie levens worden omgerekend naar de pO2 waarden met behulp van een empirisch Stern Volmer-achtige relatie (vide infra).
- Na het verzamelen van de gegevens op verschillende corticale diepten, injecteren dextran-geconjugeerde fluoresceïne kleurstof in vasculatuur voor de beeldvorming van de microvasculatuur structuur.
- Verkrijgen van een stapel van structurele beelden van de bloedvaten door het uitvoeren van de twee-foton beeldvorming van FITC fluorescentie met behulp van een groene kanaal in de vier-kanaals detector.
- Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Massachusetts General Hospital Subcommissie onderzoek Animal Care in te stellen.
3. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Panel (a) aan de linkerkant van deze figuur geeft een breed gezichtsveld beeld van de zuurstofdruk vóór de komst van een CSD golf. Paneel (b) aan de rechterkant toont de tijdelijke evolutie van de gemiddelde zuurstof druk tijdens CSD verspreiding binnen de regio van belang aangegeven op paneel (a).
Figuur 2 (avi film): Dit filmpje toont de temporele evolutie van de zuurstof druk in de hele schedel raam tijdens propagatie van de CSD golf. Schaal balk geeft zuurstof druk in millimeter kwik.
Figuur 3. 3D-projectie van de verbeelde vasculatuur stack. De grijstinten geven een volumetrische schip masker, gemaakt op basis van de structurele beeld. Gemeten pO 2 waarden hebben een kleurcode. Schaal bar is 200 micrometer. Herdrukt met toestemming van Nature Publishing Group. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toonden we twee toepassingen van de pO2 meting in corticale microvasculatuur op basis van zuurstof-afhankelijke quenching van fosforescentie. Terwijl de eerste methode op basis van CCD imaging biedt breed gezichtsveld controle van de pO2, het meten van partiële druk van zuurstof in de corticale microvasculatuur op basis van twee-foton microscopie biedt capillaire resolutie en laat beeldvorming in de diepte. Beide methoden bieden een hoge snelheid en hoge signaal-ruis metingen. Daarnaast is de levensduur fosforescentie meting van de pO2 is grotendeels ongevoelig voor de veranderingen in de optische parameters van het weefsel tijdens het experiment, die meestal een zorg voor de andere optische beeldvormende technieken die een contrast mechanisme op basis van intensiteit hebben. Gepresenteerd instrumenten kunnen kwantitatieve analyse van de dynamische levering van zuurstof en het hersenweefsel metabolisme dat zal tot een beter begrip van de neurovasculaire koppeling lood in normale en zieke hersenen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag de steun van de Amerikaanse National Institutes of Health beurzen R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 en R01EB007279 en Amerikaanse Heart Association verlenen 0855772D erkennen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
