Summary
Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) in zerebralen Gefäßen auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Tierische Vorbereitung und bildgebenden Verfahren wurden sowohl für großes Sichtfeld CCD-basierten Imaging von pO2 in Ratten und 2-Photonen-Anregung Bildgebung des pO2 bei Mäusen beschrieben.
Abstract
Die Überwachung der raum-zeitlichen Eigenschaften des zerebralen Blut-und Sauerstoffversorgung des Gewebes ist entscheidend für ein besseres Verständnis der neuro-metabolisch-vaskuläre Beziehung. Entwicklung neuer pO2 Messmodalitäten mit gleichzeitiger Überwachung von pO2 in größeren Sehfelder mit höherer räumlicher und / oder temporale Auflösung wird einen tieferen Einblick in die Funktionsweise des gesunden Gehirns zu aktivieren und haben auch erhebliche Auswirkungen auf die Diagnose und Behandlung von neurovaskulären Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer, und Kopfverletzungen.
Optische Bildgebungsverfahren haben ein großes Potenzial, um hohe räumlich-zeitliche Auflösung und quantitative Abbildung der pO2 auf Hämoglobin-Absorption im sichtbaren und nahen infraroten Bereich des optischen Spektrums Basis bieten gezeigt. Allerdings stützt sich multispektrale Messung der zerebralen Sauerstoffsättigung auf Photonen Wanderung durch die stark streuenden Hirngewebe. Schätzung und Modellierung von Gewebe optischen Parameter, die dynamischen Veränderungen während des Experiments unterziehen können, ist in der Regel für eine genaue Schätzung der Blutoxygenierung erforderlich. Auf der anderen Seite, sollte eine Schätzung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz beruht, nicht signifikant von den Veränderungen in den optischen Parametern des Gewebes beeinflusst werden und stellt ein absolutes Mass der pO2. Experimentelle Systeme, die Sauerstoff-sensitiven Farbstoffen nutzen haben in in-vivo-Studien des perfundierten Geweben sowie für die Überwachung des Sauerstoffgehaltes in Gewebekulturen, die zeigen, dass Phosphoreszenz Abschrecken ist ein potenter Technologie, mit der genauen Sauerstoff Bildgebung in der physiologischen pO2 Bereich demonstriert.
Hier haben wir mit zwei verschiedenen bildgebenden Verfahren wie der Messung von pO2 in kortikalen Gefäßen auf Phosphoreszenz lifetime imaging Basis durchführen zu demonstrieren. In ersten Demonstration präsentieren wir großes Sehfeld Bildgebung von pO2 an der kortikalen Oberfläche einer Ratte. Dieses bildgebende Verfahren ist relativ einfach Versuchsaufbau auf einer CCD-Kamera und einer gepulsten grünen Laser basiert. Ein Beispiel für die Überwachung der kortikalen Spreading Depression auf Phosphoreszenz Lebensdauer Oxyphor R3 Farbstoff vorgestellt wurde. In der zweiten Demonstration präsentieren wir Ihnen eine hohe Auflösung Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem einer Maus. Der Versuchsaufbau enthält einen speziell angefertigten 2-Photonen-Mikroskop mit Femtosekunden-Laser, elektro-optischen Modulator, und Photon-Counting Photomultiplier. Wir präsentieren ein Beispiel für die Abbildung der pO2 Heterogenität in der kortikalen Mikrovaskulatur einschließlich Kapillaren, mit einem neuartigen PtP-C343 Farbstoff mit verbesserter 2-Photonen-Anregung Querschnitt.
Klicken Sie hier, um den zugehörigen Artikel anzuzeigen Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in biologischen Systemen.
Protocol
1. Großes Sehfeld Bildgebung von pO2 in kortikalen Gefäße der Ratte
- Ratten (250 g -350 g) werden zunächst mit Isofluran betäubt, und die Arteria und Vena femoralis sind katheterisiert auf Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für intravenöse Infusion zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomie durchgeführt wird, und Ratten sind mit einer Mischung aus Luft und Sauerstoff belüftet.
- Blutproben zur Messung der Blutgase sind alle 30-45 min genommen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blutgase innerhalb der normalen physiologischen Bereich zu halten.
- Ein geschlossener Schädel-Fenster auf dem Scheitelbein 4 mm x 4 mm groß ist für die Bildgebung vorbereitet. Die Knochen und Dura entfernt und die kraniale Fenster ist mit 1,5% Agarose gefüllt und mit einem Mikroskop Deckglas. Eine zusätzliche 1 mm 2 Bohrloch auf dem Stirnbein wird verwendet, um CSD durch intrakortikale Mikroinjektion von KCl (~ 10 ul 1 M) zu induzieren. Extreme Vorsicht ist geboten, um eine Beschädigung der kortikalen Gefäße zu vermeiden. Überschüssige Wärme, mechanische Druck-oder kurzen Zeitraum von Hypoxie kann Bluthirnschranke und zu Undichtigkeiten des Farbstoffes aus dem Gefäßsystem Kompromiss in interstitiellen Raum.
- Eine Maske aus optisch opaken Material ist rund kranialen Fenster platziert. Der Zweck der Maske wird auf Phosphoreszenz Signal, das aus dem Farbstoff, der in das Gewebe von den Rändern der Dura Sache durchgesickert kommt zu absorbieren. Der Farbstoff in den interstitiellen Raum ist die Quelle des sehr hellen Phosphoreszenz, dass die Messung verderben können. Die erhöhte Helligkeit des Farbstoffs in interstitiellen Raum ist das Ergebnis der Aufbau des Farbstoffes in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt Druck und niedrigen Abkühlgeschwindigkeit. Der Schaden des Gefäßsystems in Experiment ist daher leicht durch Auftreten von hellen Flecken Phosphoreszenz, in welchem Fall die experimentellen Daten abgelehnt wird anerkannt.
- Nach Abschluss der Operation wird Isofluran eingestellt und Anästhesie ist die Chloralose (50 mg / kg iv Bolus von 40 mg / (kg h) Infusion) eingeschaltet.
- Tier ist auf einem Wagen mit Ventilator, Blutdruck und Temperatur überwachen übertragen. Während die Atmung der Raumluft, wird das Tier schnell auf die Bildgebung Setup verschoben und wieder an den Durchflussmesser mit entsprechenden Gemisch aus Luft und Sauerstoff.
- Die stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter das Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert.
- Der gepulste Laser wird eingeschaltet und auf minimale Pulsenergie. Der Lichtstrahl ist auf Pulsenergie Meter und Pulsenergie geliefert, um die Probe gerichtet wird angepasst, um nicht mehr als 10 mJ / cm 2. Der Strahl iss auf dem kranialen Fenster mit schrägen Einfallswinkel von ~ 60 Grad und Laser iss zentriert ausgeschaltet.
- Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres wurden im Rahmen der normalen physiologischen Bereich.
- Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde Oxyphor R3 in 1 ml Kochsalzlösung auf 4 x 10 -5 M Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen, ist aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Vena femoralis injiziert.
- Eine 1 M Lösung von Kaliumchlorid ist vorbereitet und ~ 1 ul ist mit der Spritze durch das Bohrloch auf dem Stirnbein injiziert, um CSD zu induzieren.
- Der Laser wird eingeschaltet und Bildgebung ist unmittelbar nach der Injektion der KCl-Lösung gestartet. Imaging der Phosphoreszenz wird während ca. 10 min durchgeführt.
- Ein weiterer Blut-Gas-Messung durchgeführt, um zu bestätigen, dass tierische physiologische Parameter noch im normalen Bereich.
- Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle Pixel durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Fitting mit statistischer Gewichtung in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt.
2. Hochauflösende Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem der Maus
- Mäuse sind narkotisiert mit isofluorene und Femoralarterie wird katheterisiert, um die Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für die Verwaltung des Farbstoffes zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C und Tiere sind spontan atmenden ein Gemisch aus Luft und Sauerstoff.
- Ein Schädel-Fenster wird nach ursprünglich von David Kleinfeld und Winfried Denk entwickeltes vorbereitet. Ein guter sollte darauf geachtet werden, um Schäden des Gefäßsystems zu vermeiden, um ein Auslaufen des Farbstoffs in interstitiellen Raum zu verhindern.
- Ein paar Blutproben zur Messung der Blutgase während eines ganzen Vorbereitung Verfahrens getroffen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blut-Gas haltenes innerhalb der normalen physiologischen Bereich.
- Das Tier ist es, die bildgebenden Einrichtung verlegt. Eine modifizierte stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter der Olympus 4X Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert.
- Ein Bild von der Schädelbasis Fenster wird mit der Digitalkamera durch die Okulare genommen, und die 4X Ziel ist es, mit der Olympus 20fach Objektiv (NA = 0,95) ersetzt.
- Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres innerhalb einer normalen physiologischen Bereich liegen.
- Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde PtP-C343 ist in 0,2 ml Kochsalzlösung, um ~ 15 nM Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Femoralarterie injiziert.
- Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die gewünschte Zeitintervall für Farbstoff Anregungs-und Emissions-Sammlung an jedem Pixel.
- Erwerben Sie eine Umfrage scannen, die eine langsame 2-dimensionalen Raster-Scan der Phosphoreszenz Intensitätsschwankung, dass das Gefäßsystem Struktur auf der aktuellen Tiefe anzeigt. Das Ziel ist senkrecht zur Schädelbasis Fenster verschoben (Z-Achse) und langsame 2D-Umfrage Scans Phosphoreszenzintensität werden mithilfe des minimal Laserleistung bei 840 nm, die Mikrogefäßen in der Bildebene zu finden.
- An jedem bildgebenden Tiefe, auf die Umfrage-Scan der Phosphoreszenz in dieser Tiefe basieren, sind eine Reihe von Punkten im Gefäßsystem gewählt, und die Aufnahme der Phosphoreszenz zerfällt in jedem Punkt ist für eine vorgegebene Anzahl von durchschnittlich wiederholt.
- Stellen Sie die gewünschte Menge an Mittelung, Messintervall und Experiment Dauer und die Messung gestartet. pO 2-Messungen werden an den ausgewählten Orten an der angegebenen Messintervall für die Dauer des Experiments erworben.
- Während der Messungen die Software erneut leitet die Anregungslasers zu den ausgewählten Orten durch Veränderung der Position des Galvanometers Scanspiegel. Die Steuerung der Galvanometer-Scannern, elektro-optische Modulator, und alle anderen Geräte werden von den Kunden zugeschnittene Software in LabView durchgeführt.
- Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle ausgewählten Punkte durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Einbau in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt.
- Nach dem Sammeln der Daten in verschiedenen kortikalen Tiefen, injizieren Dextran-konjugierten Fluorescein in Gefäßen für die Abbildung der Mikrovaskulatur Struktur.
- Besorgen Sie sich einen Stapel von strukturellen Bilder des Gefäßsystems, indem Sie die Zwei-Photonen-Imaging von FITC-Fluoreszenz mit einem grünen Kanal in der Vier-Kanal-Detektor.
- Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care Set durchgeführt.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Panel (a) auf der linken Seite dieser Figur zeigt ein weites Sichtfeld Bild von Sauerstoff Druck vor der Ankunft eines CSD-Welle. Panel (b) auf der rechten Seite zeigt die zeitliche Entwicklung der durchschnittlichen Sauerstoffdruck während CSD Ausbreitung innerhalb der Region von Interesse auf Holz markiert (a).
Abbildung 2 (AVI-Film): Dieser Film zeigt die zeitliche Entwicklung der Sauerstoff-Druck in der gesamten kranialen Fenster während der Ausbreitung der CSD-Welle. Maßstabsbalken zeigt Sauerstoffdruck in Millimeter Quecksilbersäule.
Abbildung 3. 3D-Projektion der abgebildeten Gefäße Stapel. Die Grautöne repräsentieren eine volumetrische Schiff Maske, erstellt auf der Grundlage der strukturellen Bildes. Gemessen pO 2-Werte sind farblich gekennzeichnet. Scale-Bar ist 200 Mikrometer. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben gezeigt, zwei Anwendungen der pO2-Messung in kortikalen Mikrovaskulatur auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Während die erste Methode auf CCD-Bildgebung bietet weites Sichtfeld Überwachung von pO2-, Mess-Partialdruck des Sauerstoffs in kortikalen Mikrovaskulatur auf 2-Photonen-Mikroskopie basieren bietet Kapillare Auflösung und ermöglicht die Abbildung in die Tiefe. Beide Methoden sorgen für hohe Geschwindigkeit und hohes Signal-Rausch-Messungen. Darüber hinaus ist die Phosphoreszenz Lebensdauer Messung von pO2 weitgehend unempfindlich gegen die Veränderungen in den optischen Parametern des Gewebes während des Experiments, die in der Regel die Sorge um die anderen optischen bildgebenden Verfahren, dass ein Kontrast-Mechanismus auf Basis Intensität haben. Präsentiert Instrumente ermöglichen quantitative Analyse der dynamischen Lieferung von Sauerstoff und das Hirngewebe Stoffwechsel, die zu einem besseren Verständnis der neurovaskulären Kopplung im normalen und erkrankten Gehirn führen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir möchten Unterstützung von US-amerikanischen National Institutes of Health gewährt R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 und R01EB007279 und American Heart Association gewähren 0855772D anzuerkennen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
