Summary
אנו מציגים הליך הניסוי למדידת הלחץ החלקי של החמצן (pO2) בתוך כלי הדם המוחיים מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני. הכנת בעלי חיים ונהלים הדמיה שהותוו הן עבור שדה גדול של הדמיה מבוססי CCD לאור pO2 בחולדות 2-פוטון הדמיה מבוססת עירור של pO2 בעכברים.
Abstract
ניטור מאפייני spatiotemporal הדם המוחיים חמצון רקמות הוא חיוני להבנה טובה יותר של מערכת היחסים נוירו מטבולית-וסקולרית. פיתוח שיטות חדשות למדידת pO2 עם ניטור סימולטני של pO2 בתחומים יותר של נוף עם רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ו / או הזמני יאפשר להבין טוב יותר את תפקודו של המוח נורמלי תהיה גם השפעה משמעותית על אבחון וטיפול של מחלות כגון neurovascular שבץ, מחלת אלצהיימר, וכן פגיעת ראש.
שיטות הדמיה אופטית הראו פוטנציאל גדול כדי לספק רזולוציה גבוהה spatiotemporal הדמיה כמותי של pO2 מבוסס על ספיגת המוגלובין בטווח אינפרא אדום לעין וליד של הספקטרום האופטי. עם זאת, המדידה multispectral של חמצון הדם במוח מסתמך על הגירה פוטון דרך רקמת המוח פיזור מאוד. שערוך דוגמנות של פרמטרים רקמות אופטי, אשר עשוי לעבור שינויים דינמיים במהלך הניסוי, נדרש בדרך כלל עבור הערכה מדויקת של חמצון בדם. מאידך גיסא, הערכת הלחץ החלקי של החמצן (pO2) מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני לא אמור להיות מושפע באופן משמעותי על ידי שינויים בפרמטרים אופטיים של הרקמה ומספק אמצעי המוחלט של pO2. מערכות ניסיוני לנצל חמצן רגיש צבעים הוכחו במחקרים vivo בתוך הרקמה perfused כמו גם לניטור תכנים חמצן בתרביות רקמה, מראה כי מרווה זרחני היא טכנולוגיה חזק המסוגל חמצן הדמיה מדויקת בטווח pO2 פיזיולוגיים.
כאן אנו מפגינים עם שתי שיטות הדמיה שונות כיצד לבצע מדידת pO2 ב vasculature קליפת המוח מבוסס על הדמיה החיים זרחני. בהפגנה הראשונה שאנחנו מציגים בתחום רחב של הדמיה לאור pO2 על פני קליפת המוח של חולדה. זו שיטת הדמיה התקנה ניסיונית פשוטה יחסית המבוססת על מצלמת CCD ו לייזר ירוק פעמו. דוגמה ניטור דיכאון הפצת קליפת המוח מבוסס על חייו של צבע זרחני R3 Oxyphor הוצג. בהפגנה השנייה אנו מציגים ברזולוציה גבוהה שני הפוטונים pO2 הדמיה vasculature מיקרו קליפת המוח של העכבר. הגדרת הניסוי כולל מותאם אישית בנוי 2-פוטון מיקרוסקופ עם לייזר femtosecond, אלקטרו אופטיים אפנן ו-פוטון לספור מכפיל שפופרת תמונה. אנו מציגים דוגמה של הדמיה ההטרוגניות pO2 ב microvasculature קליפת המוח כולל נימים, באמצעות רומן PTP-C343 עם צבע משופר 2-פוטון חתך עירור.
לחץ כאן כדי להציגו הקשורות סינתזה כיול של nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות.
Protocol
1. שדה רחב של הדמיה לאור pO2 ב vasculature קליפת המוח של חולדה
- חולדות (250 גרם -350 גרם) הם בתחילה הרדים עם isoflurane, ואת עורק וריד הירך הם צינתור כדי לפקח על קצב הלב, לחץ הדם, וגזים בדם, כמו גם עבור עירוי תוך ורידי. טמפרטורת הגוף נשמר 37 ± 0.1 ° C. ההנשמה מתבצעת, וחולדות מאוורר בתערובת של אוויר וחמצן.
- דגימות דם למדידת גזים בדם נלקחים כל 30-45 דקות ו אוורור הרדמה מותאמים לשמור על גזים בדם בטווח פיזיולוגי.
- חלון גולגולתי סגור על 4 מ"מ עצם הקודקודית x 4 מ"מ בגודל מוכן הדמיה. העצם הדורה יוסרו החלון גולגולתי מלא agarose 1.5% ונחתם coverslip מיקרוסקופ. נוספים 1 2 מ"מ חור בר על העצם הפרונטלית משמש כדי לגרום CSD ידי microinjection intracortical של KCl (~ 10 μl, 1 מ '). זהירות קיצוניים צריך לנקוט כדי למנוע נזק בכלי הדם של קליפת המוח. עודף חום, לחץ מכני, או תקופה קצרה של היפוקסיה עלול לפגוע במוח דם המכשול לגרום דליפה של צבע מן vasculature לחלל ביניים.
- מסכה מחומר אטום אופטית ממוקם סביב חלון גולגולתי. מטרת המסכה היא לקלוט אות זרחני כי מגיע לצבוע כי דלף לתוך הרקמה מקצות העניין הדורה. צבע במרחב ביניים הוא מקור זרחני בהיר מאוד שיכולים לקלקל את המדידה. בהירות מוגברת של צבע במרחב ביניים היא תוצאה של הצטברות של צבע בסביבה עם לחץ חמצן נמוך בשיעור נמוך מרווה. הנזק של vasculature בניסוי ולכן הוא מוכר בקלות על ידי הופעת כתמים זרחני בהיר, ובמקרה נתונים ניסיוניים נדחית.
- לאחר השלמת הניתוח, isoflurane הוא הופסק הרדמה הוא עבר alphachloralose (50 מ"ג / ק"ג בולוס תוך ורידי ואחריו 40 מ"ג / (ק"ג ח) עירוי).
- בעלי חיים מועבר על עגלה עם לחץ דם, הנשמה וניטור טמפרטורה. תוך כדי שאיפת אוויר חדר, החיה מועברת במהירות ההתקנה הדמיה כדי לחבר מחדש flowmeter עם תערובת מתאימה של אוויר וחמצן.
- המסגרת stereotaxic שמחזיק את החיה תחת המטרה. החלון גולגולתי מרוכז בתחום להציג תחת המטרה ואת מיקומו מקביל למישור המוקד.
- לייזר פעמו מופעלת ומוגדרת אנרגיה דופק מינימלי. קרן אופטית מכוונת מד דופק אנרגיה ואנרגיה הדופק נמסר המדגם הוא מותאם להיות לא יותר מ 10 mJ / 2 ס"מ. ISS קרן ממוקדת על חלון הגולגולת עם זווית אלכסונית שכיחות של ~ 60 מעלות לייזר ISS כבוי.
- גז דם מדידות והתאמות של אוורור ושל הרדמה מבוצעות עד שכל הפרמטרים הפיזיולוגיים של החיה היו בטווח פיזיולוגי.
- בהנחה כי נפח הדם הוא כ 7% ממשקל הגוף, הכמות המתאימה של R3 בדיקה זרחני Oxyphor מומס 1 מ"ל של תמיסת מלח כדי להשיג 4 x 10 -5 M הריכוז בדם של החללית. הפתרון בדיקה מוזרק דרך וריד הירך.
- פתרון 1 M של אשלגן כלורי הוא מוכן ~ 1 ul מוזרק עם המזרק דרך החור בר על העצם הקדמית כדי לגרום CSD.
- הלייזר מופעל הדמיה הוא התחיל מיד לאחר ההזרקה של הפתרון KCl. הדמיה של זרחני מבוצעת במהלך 10 דקות ~.
- מדידה נוספת גז דם מבוצעת כדי לאשר פרמטרים פיזיולוגיים חיה עדיין בתוך הטווח הנורמלי.
- חיים זרחני מתקבלים עבור כל פיקסל על ידי מתאים דעיכה מעריכית יחיד שימוש הולם מרובע ליניארית עם שקלול סטטיסטי ב-Matlab. חיים זרחני מומרים pO2 ערכים באמצעות יחסים אמפירי שטרן Volmer כמו (אינפרא vide).
2. ברזולוציה גבוהה שני הפוטונים pO2 הדמיה vasculature מיקרו קליפת המוח של העכבר
- עכברים מורדמים עם עורק isofluorene ו הירך הוא צינתור כדי לפקח על קצב הלב, לחץ הדם, וגזים בדם, כמו גם לניהול של צבע. טמפרטורת הגוף נשמר 37 ± 0.1 מעלות צלזיוס, בעלי חיים ספונטני נשימה תערובת של אוויר וחמצן.
- חלון גולגולתי מוכן על פי טכניקה שפותחה לראשונה על ידי דיוויד קליינפלד ואת Winfried Denk. טיפול טוב יש לנקוט כדי למנוע נזק של כלי הדם כדי למנוע זליגה אפשרית של צבע לחלל ביניים.
- דגימות דם כמה למדידת גזים בדם נלקחים במהלך הליך ההכנה כולה אוורור הרדמה מותאמים לשמור על גז דםes בטווח פיזיולוגי.
- החיה מועברת ההגדרה הדמיה. מסגרת stereotaxic שונה שמחזיק את החיה תחת המטרה. החלון גולגולתי מרוכז בתחום להציג תחת המטרה אולימפוס 4X ואת מיקומו מקביל למישור המוקד.
- תמונה של חלון גולגולתי הוא שצולמו במצלמה דיגיטלית דרך מהעיניות, לבין המטרה 4X מוחלפת במטרה אולימפוס 20X (NA = 0.95).
- גז דם מדידות והתאמות של אוורור ושל הרדמה מבוצעות עד שכל הפרמטרים הפיזיולוגיים של בעל החיים הם בטווח פיזיולוגי.
- בהנחה כי נפח הדם הוא כ 7% ממשקל הגוף, הכמות המתאימה של זרחני בדיקה PTP-C343 הוא מומס 0.2 מ"ל של תמיסת מלח כדי להשיג דם ~ 15 מיקרומטר ריכוז של החללית. הפתרון בדיקה מוזרק דרך עורק הירך.
- בגין הניסוי ידי הגדרת מרווחי הזמן הרצוי עבור עירור לצבוע ואיסוף פליטת כל פיקסל.
- רוכשת סריקה סקר אשר סריקה איטית 2 ממדי סריקה של ריקבון עוצמת זרחני המציג את מבנה vasculature בעומק הנוכחי. המטרה היא עברה בניצב לחלון גולגולתי (ציר Z) ואיטי סריקות סקר 2D של עוצמת זרחני נלקחים באמצעות כוח לייזר מינימלי ב 840 ננומטר למצוא את microvessels במישור הדמיה.
- בעומק כל הדמיה, המבוסס על סריקה הסקר של זרחני בעומק זה, קבוצה של נקודות בתוך vasculature הם נבחרים, ורישום דועך זרחני בכל נקודה חוזרת עבור מספר מוגדר מראש של ממוצעים.
- קבע את הסכום הרצוי בממוצע, רווח מדידה, משך הניסוי ולהתחיל המדידה. ת.ד. 2 מדידות נרכשים במיקומים נבחרים במרווח המדידה המפורטים למשך הניסוי.
- במהלך המדידות, התוכנה מחדש מכוון את הלייזר עירור על המיקומים שנבחרו על ידי שינוי המיקום של המראות סריקה גלונומטר. שליטה על סורקים גלונומטר, אפנן אלקטרו אופטי, וכל ציוד אחר מבוצעות על ידי תוכנה בהתאמה אישית ב LabVIEW.
- חיים זרחני מתקבלים עבור כל הנקודות שנבחרו על ידי מתאים דעיכה מעריכית יחיד שימוש הולם מרובע קוי ב-Matlab. חיים זרחני מומרים pO2 ערכים באמצעות יחסים אמפירי שטרן Volmer כמו (אינפרא vide).
- לאחר איסוף הנתונים בעומקים שונים בקליפת המוח, להזריק dextran-מצומדות צבע פלואורסצנטי לתוך vasculature הדמיה המבנה microvasculature.
- השג ערימה של תמונות המבנית של vasculature ידי ביצוע הדמיה שני פוטונים של הקרינה FITC להשתמש בערוץ הירוק גלאי ארבע הערוץ.
- ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת המשנה החולים הכללי מסצ'וסטס על טיפול בבעלי חיים למחקר.
3. נציג תוצאות:
1. תרשים לוח (א) בצד שמאל של נתון זה מציג שדה רחב של נוף תמונה של לחץ חמצן לפני ההגעה של גל CSD. לוח (ב) בצד ימין ניתן לראות את האבולוציה הזמני של לחץ החמצן הממוצע במהלך התפשטות CSD בתוך האזור של עניין מסומן בלוח (א).
איור 2 (avi סרט): סרט זה מציג את האבולוציה הזמני של לחץ החמצן בחלון הגולגולת כולה במהלך התפשטות של הגל CSD. בר מציין סולם לחץ החמצן מילימטרים של כספית.
איור 3. הקרנת 3D של מחסנית vasculature הדמיה. גוונים של אפור מייצגים מסכה כלי נפח, שנוצר על בסיס התמונה מבניים. נמדד ת.ד. 2 ערכים מסומנים בצבעים. בר סולם הוא 200 מיקרומטר. התפרסם באישור קבוצת פרסום הטבע 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הראינו שתי בקשות המדידה pO2 ב microvasculature קליפת המוח מבוסס על מרווה חמצן תלויי של זרחני. בעוד השיטה הראשונה מבוססת על CCD הדמיה מספקת בתחום רחב של ניטור לאור pO2, מדידת הלחץ החלקי של החמצן microvasculature קליפת המוח על בסיס מיקרוסקופיה 2-פוטון מספקת רזולוציה נימי ומאפשר הדמיה לעומק. שתי השיטות לספק מהירות גבוהה גבוהה אות לרעש מדידות. בנוסף, המדידה החיים זרחני של pO2 הוא רגיש במידה רבה לשינויים בפרמטרים אופטיים של הרקמה במהלך הניסוי, שהיא בדרך כלל דאגה טכניקות אחרות הדמיה אופטית כי יש מנגנון ניגודיות מבוסס על עוצמה. המכשירים שהוצגו מאפשרות ניתוח כמותי של משלוח הדינמי של חמצן ברקמת המוח חילוף החומרים שיוביל להבנה טובה יותר של צימוד neurovascular במוח בריאים וחולים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות תמיכה של ארה"ב National Institutes of Health מענקים R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 ו R01EB007279 ו American Heart Association מענק 0855772D.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
