Medición de la oxigenación sanguínea cerebral basada en el oxígeno-dependiente de enfriamiento de fosforescencia

Summary

Se presenta un procedimiento experimental para la medición de la presión parcial de oxígeno (pO2) en la vasculatura cerebral basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia. Preparación de animales y los procedimientos de imagen se describe, tanto para el campo visual amplio CCD basado en imágenes de la pO2 de las ratas y 2-fotones de imágenes basado en la excitación de la pO2 de ratones.

Abstract

Seguimiento de las características espacio-temporales de la sangre cerebral y la oxigenación tisular es crucial para una mejor comprensión de la relación neuro-metabólico-vasculares. Desarrollo de nuevas modalidades de medición pO2 con un control simultáneo de pO2 en grandes campos de visión con mayor resolución espacial y / o temporal que permitirá una mayor penetración en el funcionamiento del cerebro normal y también tendrá un impacto significativo en el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades neurovasculares como accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, y lesiones en la cabeza.

Modalidades de imágenes ópticas han demostrado un gran potencial para proporcionar alta resolución espacio-temporal y de imagen cuantitativa de pO2 basado en la absorción de la hemoglobina en el rango visible e infrarrojo cercano del espectro óptico. Sin embargo, la medición multiespectral de la oxigenación sanguínea cerebral se basa en la migración de fotones a través del tejido cerebral de alta dispersión. Estimación de parámetros y modelado de tejidos ópticos, que pueden sufrir cambios dinámicos durante el experimento, que normalmente se requiere una estimación precisa de la oxigenación de la sangre. Por otro lado, la estimación de la presión parcial de oxígeno (pO2) basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia no debe verse afectado significativamente por los cambios en los parámetros ópticos de los tejidos y proporciona una medida absoluta de pO2. Sistemas experimentales que utilizan tintes sensibles al oxígeno se ha demostrado en estudios in vivo del tejido perfundido, así como para monitorear el contenido de oxígeno en cultivos de tejidos, demostrando que la fosforescencia de enfriamiento es una tecnología potente capaz de obtener imágenes precisas de oxígeno en el rango fisiológico pO2.

Aquí se demuestra con dos modalidades de imágenes diferentes de cómo realizar la medición de la pO2 en la vasculatura cortical sobre la base de imágenes de toda la vida fosforescencia. En la primera demostración se presenta amplio campo de visión de imágenes de la pO2 en la superficie cortical de una rata. Esta modalidad de imagen tiene la configuración experimental relativamente simple basado en una cámara CCD y un láser pulsado verde. Un ejemplo de control de la propagación de la depresión cortical sobre la base de toda la vida fosforescencia de tinte R3 Oxyphor fue presentado. En segunda manifestación se presenta una alta resolución de dos fotones pO2 imagen en la vasculatura cortical micro de un ratón. El dispositivo experimental incluye una hecha a la medida de 2 fotones con microscopio láser de femtosegundo, modulador electro-óptico, y el fotón-contando tubo foto multiplicador. Se presenta un ejemplo de imagen de la heterogeneidad pO2 en la microvasculatura corticales incluyendo capilares, utilizando un nuevo punto a punto-C343 colorante con una mejora de dos fotones sección transversal de excitación.

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Protocol

1. Amplio campo de visión de imágenes de la pO2 en la vasculatura cortical de una rata

1. Las ratas (250 g -350 g) son inicialmente anestesiados con isoflurano, y la arteria femoral y la vena se cateteriza para controlar la frecuencia cardiaca, presión arterial y los gases en sangre, así como para la infusión intravenosa. La temperatura corporal se mantiene a 37 ± 0,1 ° C. Traqueotomía se realiza, y las ratas son ventilados con una mezcla de aire y oxígeno.
2. Las muestras de sangre para medir los gases en sangre se toman cada 30-45 minutos y la ventilación y la anestesia se ajustan para mantener los gases de la sangre dentro del rango fisiológico normal.
3. Una ventana cerrada del cráneo en el hueso parietal 4 mm x 4 mm de tamaño se prepara para la imagen. El hueso y la duramadre se eliminan y la ventana del cráneo está lleno de agarosa al 1,5% y se sella con un cubreobjetos microscopio. Un adicional de 1 mm ² trepanación en el hueso frontal se utiliza para inducir la CDS por microinyección intracortical de KCl (~ 10 l, 1 M). Deben extremarse las precauciones para evitar cualquier daño de los vasos corticales. El exceso de calor, presión mecánica, o breve período de hipoxia puede comprometer la barrera sanguínea del cerebro y causar fugas de la tintura de los vasos al espacio intersticial.
4. Una máscara de material ópticamente opaco se coloca alrededor de las ventanas del cráneo. El propósito de la máscara es la de absorber la señal de fosforescencia que viene de la tinta que se filtró en el tejido de los bordes de la materia dura. El medio de contraste en el espacio intersticial es la fuente de la fosforescencia muy brillante que puede echar a perder la medición. El aumento de brillo de la tinta en el espacio intersticial es el resultado de la acumulación de la tinta en el medio ambiente con baja presión de oxígeno y la baja velocidad de enfriamiento. El daño de los vasos en el experimento es por lo tanto, fácilmente reconocible por la aparición de manchas brillantes fosforescencia, en cuyo caso se rechaza los datos experimentales.
5. Después de terminar la cirugía, el isoflurano se interrumpe y la anestesia se pasó a alfacloralosa (50 mg / kg en bolo intravenoso seguido de 40 mg / (kg h) de infusión).
6. Animal es trasladado en un carro con la presión arterial ventilador, y controlar la temperatura. Mientras se respira el aire de la habitación, el animal se mueve rápidamente hacia la configuración de imagen y vuelve a conectar el medidor con la mezcla adecuada de aire y oxígeno.
7. El marco estereotáxico que tiene el animal se encuentre en el objetivo. La ventana del cráneo se centra en el campo de visión en el objetivo y se coloca paralela al plano focal.
8. El láser pulsado se enciende y se puso a la energía de pulso mínimo. El haz óptico se dirige hacia medidor de energía de pulso y pulso de energía entregada a la muestra se ajusta a no más de 10 mJ / cm ^2. La ISS rayo centrado en la ventana del cráneo con un ángulo de incidencia oblicua de ~ 60 grados y la ISS láser apagado.
9. Mediciones de gases en sangre y los ajustes de la ventilación y la anestesia se llevan a cabo hasta que todos los parámetros fisiológicos de los animales estuvieron dentro del rango fisiológico normal.
10. Suponiendo que el volumen de sangre es de aproximadamente el 7% del peso corporal, una cantidad adecuada de la sonda R3 Oxyphor fosforescencia se disuelve en 1 ml de solución salina para alcanzar 4 x 10 ^-5 M la concentración sanguínea de la sonda. La solución de la sonda se inyecta a través de la vena femoral.
11. Una solución 1 M de cloruro de potasio se prepara y ~ 1 ul se inyecta con una jeringa a través de la trepanación en el hueso frontal para inducir a la CDS.
12. El láser se enciende y la imagen se inicia inmediatamente después de la inyección de la solución de KCl. Imágenes de fosforescencia se lleva a cabo durante aproximadamente 10 min.
13. Otra medición de gases en sangre se realiza para confirmar que los parámetros fisiológicos de los animales se encuentran dentro del rango normal.
14. Vidas fosforescencia se obtienen para todos los píxeles mediante el ajuste de la decadencia exponencial con una sola conexión cuadrados no lineal con ponderación estadística en Matlab. Fosforescencia vidas se convierten en los valores de pO2 con una empírica de Stern Volmer-como la relación (vide infra).

2. Alta resolución de dos fotones pO2 imagen en la vasculatura cortical micro de un ratón

1. Los ratones se anestesian con la arteria femoral y isofluorene se cateteriza para controlar la frecuencia cardiaca, presión arterial y los gases en sangre, así como para la administración del medio de contraste. La temperatura corporal se mantiene a 37 ± 0,1 ° C y los animales respiran de manera espontánea una mezcla de aire y oxígeno.
2. Una ventana craneal se prepara de acuerdo a la técnica desarrollada originalmente por David Kleinfeld y Winfried Denk. Un buen cuidado se debe tomar para evitar cualquier daño de los vasos para evitar posibles fugas del medio de contraste en el espacio intersticial.
3. A pocas muestras de sangre para medir los gases en sangre se toman durante un procedimiento de preparación y de ventilación y anestesia se ajustan para mantener el gas en la sangrees dentro del rango fisiológico normal.
4. El animal se mueve a la configuración de imágenes. Un marco estereotáxico modificado que tiene el animal se encuentre en el objetivo. La ventana del cráneo se centra en el campo de visión del objetivo Olympus 4X y se coloca paralela al plano focal.
5. Una imagen de la ventana del cráneo es tomada con la cámara digital a través de los oculares, y el objetivo de 4X se reemplaza con el objetivo de Olympus 20X (NA = 0,95).
6. Mediciones de gases en sangre y los ajustes de la ventilación y la anestesia se llevan a cabo hasta que todos los parámetros fisiológicos de los animales dentro de un rango fisiológico normal.
7. Suponiendo que el volumen de sangre es de aproximadamente el 7% del peso corporal, una cantidad apropiada de la fosforescencia de la sonda PTP-C343 se disuelve en 0,2 ml de solución salina para alcanzar la concentración sanguínea de aproximadamente 15 M de la sonda. La solución de la sonda se inyecta a través de la arteria femoral.
8. Comenzar el experimento mediante el establecimiento de los intervalos de tiempo deseado para la excitación del tinte y la recolección de emisión en cada píxel.
9. Adquirir un escáner encuesta que es un proceso lento de 2 dimensiones barrido de trama de la decadencia intensidad fosforescencia que muestra la estructura vascular a la profundidad actual. El objetivo se mueve perpendicular a la ventana del cráneo (eje Z) y lento exploraciones estudio de la intensidad de fosforescencia en 2D se realizan usando la potencia del láser en un mínimo de 840 nm para encontrar los microvasos en el plano de la imagen.
10. En cada una profundidad de imagen, basado en la exploración encuesta de fosforescencia a esa profundidad, un conjunto de puntos dentro de la vasculatura son seleccionados, y el registro de fosforescencia decae en cada punto se repite para un número predefinido de promedio.
11. Establecer la cantidad deseada de un promedio, intervalo de medición, y la duración de la prueba y empezar la medición. PO ₂ mediciones se adquieren en los lugares seleccionados en el intervalo de medición especificado para la duración del experimento.
12. Durante las mediciones, el software de re-dirige el láser de excitación de las ubicaciones seleccionadas por el cambio de la posición de los espejos galvanómetro de escaneado. Control de los escáneres galvanómetro, modulador óptico electro, y el resto del equipo se realizan por software a medida en LabView.
13. Vidas fosforescencia se obtienen todos los puntos seleccionados mediante el ajuste de la decadencia exponencial con una sola conexión cuadrados no lineales en Matlab. Fosforescencia vidas se convierten en los valores de pO2 con una empírica de Stern Volmer-como la relación (vide infra).
14. Después de recoger los datos en diferentes profundidades corticales, inyectar dextrano conjugado con fluoresceína en la vasculatura para obtener imágenes de la estructura de la microvasculatura.
15. Obtener una pila de imágenes estructurales de los vasos mediante la realización de la imagen de dos fotones de FITC fluorescencia utilizando un canal verde en el detector de cuatro canales.
16. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Subcomité Hospital General de Massachusetts en Investigación en Atención Animal.

3. Los resultados representativos:

Figura 1. Panel (a) en el lado izquierdo de esta figura se muestra un amplio campo de la imagen de vista de la presión de oxígeno antes de la llegada de una ola de CSD. El panel (b) en el lado derecho muestra la evolución temporal de la presión de oxígeno promedio durante la propagación de la CDS en la región de interés marcados en el panel (a).

Figura 2 (la película de AVI): Esta película muestra la evolución temporal de la presión de oxígeno en la ventana del cráneo entero durante la propagación de la onda de la CDS. Barra de escala indica la presión de oxígeno en milímetros de mercurio.

Figura 3. Proyección en 3D de la pila de vasos imagen. Los tonos de gris representan una máscara de vasos volumétricos, creado en base a la imagen estructural. Medido valores de pO ₂ están codificados por color. Barra de escala es de 200 micrómetros. Reproducido con permiso de Nature Publishing Group. ⁷

Discussion

Hemos demostrado dos aplicaciones de la medición de pO2 en la microvasculatura cortical basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia. Aunque el primer método basado en imágenes CCD ofrece amplio campo de vista del control pO2, la medición de la presión parcial de oxígeno en la microvasculatura cortical sobre la base de dos fotones microscopía capilar ofrece una resolución de imagen y permite en profundidad. Ambos métodos proporcionan alta velocidad y las mediciones de relación señal-ruido. Además, la medición de toda la vida fosforescencia de pO2 es en gran medida insensible a los cambios en los parámetros ópticos de los tejidos durante el experimento, que suele ser una preocupación para las técnicas de imagen óptica que otros tienen un mecanismo de cambio basada en la intensidad. Instrumentos presentados permiten un análisis cuantitativo de la entrega dinámica de oxígeno y el metabolismo de los tejidos del cerebro que conducen a una mejor comprensión de acoplamiento neurovascular en el cerebro normal y una enferma

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glycopyrrolate	Reagent	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions.
Lidocaine HCL	Reagent	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Used as the local anesthesia during surgeries.
Isoflurane	Reagent	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice.
Alpha Chloralose	Reagent	Sigma-Aldrich	C0128	Used as a general anesthesia during experiments with rats.
Fluorescein isothio-cyanate–dextran	Reagent	Sigma-Aldrich	FD2000S	Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood.