Summary
Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı serebral vasküler yapılarda kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçmek için deneysel bir prosedür mevcut. Hayvan hazırlama ve görüntüleme yöntemleri pO2 görüntüle CCD tabanlı görüntüleme büyük alan sıçanlarda ve farelerde pO2 2-foton uyarma bazlı görüntüleme için özetlenen.
Abstract
Serebral kan ve doku oksijenasyonu uzaysal özelliklerinin izlenmesi nöro-metabolik-vasküler ilişkinin daha iyi anlaşılması için çok önemlidir. PO2 bakış daha geniş alanlarda daha yüksek uzaysal ve / veya zamansal çözünürlük ile eş zamanlı olarak izlenmesi ile yeni pO2 ölçüm yöntemlerinin geliştirilmesi, normal beyin işleyişi daha iyi kavramanızı sağlayacak gibi nörovasküler hastalıkların tanı ve tedavisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olacak inme, Alzheimer hastalığı ve kafa travması.
Optik görüntüleme yöntemleri, optik spektrum görünür ve yakın kızılötesi aralığında hemoglobin emilimi dayalı yüksek uzaysal çözünürlük ve pO2 kantitatif görüntüleme sağlamak için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, serebral kan oksijenlenme multispektral ölçümü son derece saçılma beyin dokusu ile foton göç dayanmaktadır. Tahmin ve deney sırasında dinamik değişikliklere doku optik parametreleri, modelleme, genellikle kan oksijenlenme doğru tahmini için gereklidir. Öte yandan, fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı kısmi oksijen basıncı (pO2) tahmini doku optik parametreleri değişiklikler önemli ölçüde etkilenen ve pO2 mutlak bir ölçü sağlar olmamalıdır. Oksijen duyarlı boyalar kullanan Deneysel sistemleri yanı sıra fizyolojik pO2 aralığı doğru oksijen görüntüleme yeteneğine sahip güçlü bir teknoloji olduğunu fosforesans su verme gösteren, doku kültürleri oksijen içeriğini izlemek için perfüze doku in vivo çalışmalarda gösterilmiştir.
Burada nasıl fosforesans ömrü görüntüleme dayalı kortikal damarsal ölçümü pO2 gerçekleştirmek için iki farklı görüntüleme yöntemleri ile ortaya koymaktadır. Ilk gösteride bir sıçan kortikal yüzeyde pO2 görüntüle görüntüleme geniş alan mevcut. Bu görüntüleme yöntemi, nispeten basit bir CCD kamera ve darbeli bir yeşil lazer dayalı deney düzeneği vardır. Oxyphor R3 boya fosforesans ömrü dayalı kortikal yayılan depresyon izlenmesi bir örnek sunuldu. Ikinci gösteri yüksek çözünürlüklü iki foton bir fare kortikal mikro vasküler yapılarda pO2 görüntüleme sunuyoruz. Deney düzeneği, femtosecond lazer, elektro-optik modülatör ve foton sayma fotoğraf çarpan tüp ile özel bir dahili 2-foton mikroskop içerir. Biz PtP-C343 boya ile gelişmiş bir roman 2-foton ikaz kesiti kullanarak, kılcal damarlar da dahil olmak üzere kortikal mikrodolaşımını pO2 heterojenite görüntüleme bir örnek sunuyoruz.
Ilgili makaleyi görüntülemek için buraya tıklayın Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon.
Protocol
1. Geniş bir sıçan kortikal damarsal pO2 görüntüle görüntüleme alanında
- Rats (250 g -350 g), başlangıçta izofluran ile anestezi ve femoral arter ve damar, kalp hızı, kan basıncı ve kan gazları yanı sıra intravenöz infüzyon için izlemek için kateterize. Vücut sıcaklığı ± 0.1 ° C 37 korunur Trakeotomi yapılır ve sıçanlarda hava ve oksijen karışımı ile havalandırılan.
- Kan gazları ölçmek için kan örnekleri her 30-45 dakikada bir alınır ve ventilasyon ve anestezi, kan gazları normal fizyolojik aralığında tutmak için ayarlanır.
- Parietal kemik boyutu 4 mm x 4 mm kapalı bir kafa pencere görüntüleme için hazırlanmıştır. Kemik ve dura kaldırılır ve kraniyal pencere% 1.5 agaroz ile doldurulur ve bir mikroskop lamel ile mühürlenir. Frontal kemik bir ek 1 mm 2 burr hole KCl (~ 10 ul, 1 M) intrakortikal mikroenjeksiyon CSD ikna etmek için kullanılır. Kortikal vaskülatürü herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Aşırı ısı, mekanik basınç veya hipoksi kısa bir süre interstisyel boşluğa damar, kan beyin bariyerini ve boya neden kaçak tehlikeye atabilir.
- Kafatası pencere içinde optik opak malzemeden bir maske yerleştirilir. Maske amacı kenarlarından dura maddenin doku içine sızan boya gelen fosforesans sinyal emmek için. Interstisyel alan boya ölçümü bozabilir çok parlak fosforesans kaynağıdır. Interstisyel uzayda boya artan parlaklığı düşük oksijen basıncı ve düşük su verme oranı ile çevre boya birikmesi sonucu. Deneyde, damarsal hasar nedenle, deneysel veriler bu durumda reddedilir parlak fosforesans lekeler, görünümünü kolayca tanınır.
- Ameliyatın tamamlanmasından sonra, izofluran kesilmeli ve anestezi alphachloralose (50 mg / kg intravenöz bolus 40 mg / (kg saat) infüzyon takip) geçti.
- Hayvan ventilatör bir arabası, kan basıncı ve sıcaklık monitörü ile aktarılır. Oda havası nefes alırken, hayvan görüntüleme kurulum hızlı bir şekilde taşınır ve uygun hava ve oksijen karışımı ile debimetre yatışma.
- Hayvan tutan stereotaksik çerçeve amaç altına yerleştirilir. Kafatası penceresi hedefi altında görüş alanı merkezli ve odak düzlemine paralel olarak konumlandırılmış.
- Darbeli lazer açık ve minimum darbe enerji ayarlanır. Optik ışın demeti 10 mJ / cm 2 den fazla olmayacak şekilde ayarlanır darbe enerji ölçüm ve numune teslim darbe enerji doğru yönlendirilir. Kraniyal pencerede merkezli ışın iss, ~ 60 derece ve lazer iss eğik insidansı açı ile kapalıdır.
- Hayvanın tüm fizyolojik parametreleri normal fizyolojik aralığında kadar kan gazı ölçümleri ve havalandırma ve anestezi ayarlamalar yapılmaktadır.
- Varsayarsak, bu kan hacmi fosforesans prob Oxyphor R3 uygun bir miktar prob 4 x 10 -5 M kan konsantrasyonu elde etmek için 1 ml serum fizyolojik içinde çözülür, vücut ağırlığının yaklaşık% 7. Prob çözüm femoral ven yoluyla enjekte edilir.
- 1 M potasyum klorür çözeltisi hazırlanır ve frontal kemik çapak delikten ~ 1 ul CSD ikna etmek için şırınga ile enjekte edilir.
- Lazer açık ve görüntüleme KCl çözeltisi enjeksiyonundan hemen sonra başladı. Fosforesans Görüntüleme ~ 10 dakika boyunca yapılır.
- Başka bir kan gazı ölçümü, hayvanın fizyolojik parametreler normal sınırlarda olduğunu doğrulamak için yapılır.
- Fosforesans yaşamlarda, doğrusal olmayan kare uydurma Matlab istatistiksel ağırlık kullanarak tek bir üstel bozulma takarak tüm pikseller için elde edilir. Fosforesans yaşamlarda Stern Volmer gibi ampirik bir ilişki (vide infra) kullanarak pO2 değerleri dönüştürülür.
2. Yüksek çözünürlüklü iki foton bir fare kortikal mikro vasküler yapılarda pO2 görüntüleme
- Isofluorene ve femoral arter, kalp hızı, kan basıncı ve kan gazları, aynı zamanda boya yönetim olarak izlemek için kateterize fareler anestezi. Vücut ısısı 37 korunur ± 0.1 ° C ve hayvanlar hava ve oksijen karışımı kendiliğinden nefes.
- Kranial pencere başlangıçta David Kleinfeld ve Winfried Denk tarafından geliştirilen tekniğe göre hazırlanmıştır. Interstisyel boşluğa boya sızıntısını önlemek için vaskülatürü herhangi bir zarar görmesini önlemek için iyi bir bakım alınmalıdır.
- Birkaç kan gazları ölçmek için kan örnekleri bir bütün hazırlık prosedürü sırasında alınır ve kan gazı tutmak için havalandırma ve anestezi ayarlanırnormal fizyolojik aralığında es.
- Hayvan görüntüleme kurulum taşınır. Hayvan tutan bir değiştirilmiş stereotaksik çerçeve amaç altına yerleştirilir. Kafatası pencere Olympus 4X hedefi altında görüş alanı merkezli ve odak düzlemine paralel olarak konumlandırılmış.
- Kraniyal penceresinin bir görüntü göz mercekleri ile dijital kamera ile çekilen ve 4X objektif Olympus 20X objektif (NA = 0.95) ile değiştirilir.
- Hayvanın tüm fizyolojik parametreleri normal bir fizyolojik aralığında kadar kan gazı ölçümleri ve havalandırma ve anestezi ayarlamalar yapılmaktadır.
- Varsayarsak, bu kan hacminin vücut ağırlığının yaklaşık% 7, uygun bir miktarda fosforesans prob PtP-C343, 0.2 mL ~ 15 prob mcM kan konsantrasyonu elde etmek için tuzlu su içinde çözülür. Prob çözüm femoral arter yoluyla enjekte edilir.
- Her pikselin boya uyarma ve emisyon koleksiyonu için istenilen zaman aralıklarında ayarlayarak deney başlayın.
- Mevcut derinlikte damar yapısını görüntüler fosforesans yoğunluğu çürüme yavaş bir 2-boyutlu raster tarama bir anket tarama edinin. Amacı kraniyal pencerede dik taşınır (Z ekseni) ve fosforesans yoğunluğu yavaş 2D anket taramaları görüntü düzlemi mikrodamarlar bulmak için en az 840 nm lazer gücünü kullanarak alınır.
- Her görüntüleme derinliği, bu derinlikte fosforesans anket tarama dayalı, damar içinde bir dizi puan seçilir ve her noktada fosforesans bozunur kayıt önceden tanımlanmış bir ortalama sayısı için tekrarlanır.
- İstenen ortalama miktarı, ölçüm aralığı ve Deneme süresini ayarlayın ve ölçüm başlar. pO 2 ölçüm, deney süresince, seçilen noktada belirtilen ölçüm aralığı elde edilir .
- Ölçümleri sırasında, yazılım galvanometre tarama ayna konumunu değiştirerek seçilen yerlere uyarma lazer yeniden yönlendirir. Galvanometre tarayıcılar, elektro optik modülatör, ve tüm diğer ekipman kontrolü LabView özel yapılmış yazılım tarafından yapılmaktadır.
- Fosforesans yaşamlarda Matlab doğrusal olmayan kare uydurma kullanarak tek bir üstel bozulma uygun seçilen tüm noktalar için elde edilir. Fosforesans yaşamlarda Stern Volmer gibi ampirik bir ilişki (vide infra) kullanarak pO2 değerleri dönüştürülür.
- Kortikal çeşitli derinliklerde veri topladıktan sonra, görüntüleme mikrovasküler yapının vasküler içine dekstran-konjuge floresein boya enjekte edilir.
- Damarsal yapısal görüntüleri dört-kanallı dedektörü yeşil bir kanal kullanılarak FITC floresanı iki foton görüntüleme gerçekleştirerek bir yığın alın.
- Araştırma Hayvan Bakım Massachusetts General Hospital Alt Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1 bu rakamın sol tarafında Panel (a), oksijen basıncı bakış görüntü CSD dalga gelmeden önce geniş bir alanda görüntüler . Sağ tarafta Paneli (b), panel üzerinde işaretlenmiş ilgi bölge içinde CSD yayılımı sırasında ortalama oksijen basıncı (a), zamansal evrimi gösterir.
Şekil 2 (AVI film): Bu film CSD dalga yayılması sırasında tüm kafa penceresinde oksijen basıncı zamansal evrim gösterir. Ölçeği bar oksijen basıncı milimetre cıva gösterir.
Şekil 3 görüntülü damarsal yığını 3D projeksiyon. Gri tonları, hacimsel bir gemi maske temsil yapısal görüntü göre oluşturulur. Ölçülen pO 2 değerleri, renk kodlu . Ölçek çubuğu 200 mikrometre. Nature Publishing Group izni ile yayımlanmaktadır. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı kortikal mikrodolaşımını pO2 ölçüm iki uygulama göstermiştir. CCD görüntüleme dayalı ilk yöntem 2-foton mikroskopi dayalı kortikal mikrodolaşımını oksijen kısmi basıncı ölçme, pO2 bakış izleme geniş bir alan sağlarken, kapiller çözünürlüğü sağlar ve derinlemesine görüntüleme sağlar. Her iki yöntem de yüksek hız ve yüksek sinyal-gürültü ölçümleri sağlar. Buna ek olarak, pO2 fosforesans ömrü ölçümü, genellikle yoğunluğuna göre kontrast bir mekanizmaya sahip diğer optik görüntüleme teknikleri bir endişe deney sırasında doku optik parametreleri değişiklikleri büyük ölçüde duyarsız. Sunan aletleri kantitatif analiz ve dinamik teslim oksijen beyin dokusu metabolizması normal ve hastalıklı beyin nörovasküler kaplin daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır izin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz, ABD Ulusal Sağlık hibe R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050 R01HL081273 ve R01EB007279 ve Amerikan Kalp Birliği hibe 0855772D Enstitüsü'nün desteğiyle kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycopyrrolate | Reagent | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Used to control pharyngeal, tracheal, and bronchial secretions. |
| Lidocaine HCL | Reagent | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Used as the local anesthesia during surgeries. |
| Isoflurane | Reagent | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Used as a general inhalation anesthetic drug during surgeries and as a general anesthesia during experiments with mice. |
| Alpha Chloralose | Reagent | Sigma-Aldrich | C0128 | Used as a general anesthesia during experiments with rats. |
| Fluorescein isothio-cyanate–dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD2000S | Administrated to create ~ 500 nM concentration in blood. |
References
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
