Biology

Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

Published: January 6, 2010 doi: 10.3791/1695

Shawn Oppegard¹, Elly Sinkala¹, David Eddington¹

¹Bioengineering, University of Illinois

Summary

Fabricage en validatie van een add-on platform dat betere controle over de ruimtelijke en temporele oxygenatie in een 6-wells plaat biedt. Het apparaat is aan te passen aan een aantal cultuur-systemen en kan worden gebruikt om de effecten van zuurstof op wondgenezing te onderzoeken.

Abstract

Zuurstof is een belangrijke modulator van vele cellulaire mechanismen, maar de huidige apparaten toestaan

Protocol

1. Het apparaat de functie

De hypoxische insert apparaat bevat 6-pilaren die nest in een standaard 6-well plaat. Gas stroomt in de pijler, over een microfluïdisch netwerk aan de voet van de pilaar, en stroomt weer uit het apparaat. Aan de voet van de pilaar die de bodemwand van de microchannel is een 100 urn dikke gas-permeabel membraan dat PDMS zuurstof diffusie toelaat tussen de gas-microchannel en de cultuur media. Zo is het apparaat werkt door de oprichting van een concentratiegradiënt die de media zuurstofconcentratie rijdt op weg naar een gewenste waarde.
Het toestel biedt een aantal voordelen ten opzichte van de hypoxische kamer en andere cel zuurstoftoevoer: 1) minimaliseert het zuurstofdiffusie pad het toelaat sneller tijdelijke controle, 2) verbetert de ruimtelijke controle over de zuurstof, zo afhankelijk van de pilaar microchannel ontwerp, 3) beschikt over een kleinere lab voetafdruk en een hogere doorvoersnelheid tot experimentele efficiëntie te verhogen, en 4) zich aanpast aan gemeenschappelijke cel cultuur instrumenten (bv. multiwell-plaat) zonder de noodzaak van gespecialiseerde kennis en apparatuur.

2. Apparaat fabricage

De eerste pijler van de array replica gevormd met PDMS in een eerder machinaal Delran mal.
Vervolgens wordt het gas microchannel aan de onderkant van elke pijler is vervaardigd met behulp van standaard SU-8 fotolithografie en PDMS replica gieten.
De gas-permeabel membraan wordt gefabriceerd door gedefinieerd draaien van PDMS op een silicium wafer tot de gewenste dikte te bereiken. In dit voorbeeld gebruiken we een 100 urn dikke membraan, die werd gefabriceerd door het draaien van 500 rpm gedurende 10 seconden en 900 rpm gedurende 30 seconden.
Alle componenten zijn gebonden bij elkaar na zuurstof plasma behandeling met een handheld plasma-apparaat (model BD-20, Electro-Technic Products).

3. Apparaat instellen

Voorzichtig apparaat op de plaat, en zorg ervoor om luchtbellen te vermijden. Hengelsport het apparaat tijdens het inbrengen helpt om luchtbellen te verdrijven uit een kant. Voor actuele cel-gebaseerde experimenten, moet deze stap worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroming kap. De kans op besmetting sterk verminderd zodra het apparaat wordt geplaatst, zodat de montage kan worden overgedragen naar de incubator in een niet-steriele omgeving.
Sluit de leidingen van de bron gas tank tot de in-en uitlaatpoorten van het apparaat. Voor cel-gebaseerde experimenten, moet de cultuur couveuse hebben een gat om buizen in-en de slang moet worden aangesloten na het uitvoeren van het apparaat en het plaatsen van het in de couveuse vergunning. Wees voorzichtig om te vermijden dat teveel druk op het apparaat, die voldoende zou kunnen vervormen van de PDMS naar de onderliggende cellen te vernietigen.
Zorg ervoor dat de precisie debietregelaar wordt gesloten voordat het openen van de tank top regulator om te voorkomen dat overloopt van het apparaat. Start de gasstroom. Open voorzichtig precisie debietregelaar om de gewenste debiet (50-100 ml / min). Kijk goed naar de waarde in de komende uren en aanpassingen nodig, omdat de drukval zal veranderen terwijl het systeem evenwicht houdt, het veranderen van het debiet. Om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen in de media, verminder de luchtstroming tussen 10-20 ml / min na een eerste 15 minuten evenwicht duur met het hogere debiet.
Nadat de gewenste experimentele duur, stop gasstroom, verwijder de plaat, en het proces-cellen dienovereenkomstig (bijv. lyse, beits, tellen, etc.).

4. Apparaat Validatie

Ijking
1. Selecteer het aantal en de locatie van de posities op de fluorescerende zuurstof
  (FOXY) sensor slide (afhankelijk van de validatie-eisen) dat zal worden gebruikt voor zuurstof meting. De dia bevat een fluorescerende kleurstof ruthenium coating die wordt gedoofd door zuurstof.
2. Expose slide direct naar 0, 10, en 21% zuurstof uit gas tank en foto's maken na 5 minuten voor een goede evenwicht.
3. Exporteer het gemiddelde beeldintensiteit voor elke positie en plot zuurstof concentratie afhankelijk van fluorescentie-intensiteit.
4. Genereer ijkgrafiek door het aanbrengen van lineaire bocht naar 0-10% 10-21% lijn en lijn.
Heterogeniteit
1. Stel meerdere punten verspreid over de breedte van het kanaal op een gedefinieerde interval (bijv. om de 1 mm). Merk op dat er wellicht overlap van beelden, afhankelijk van de afstand.
2. Meet de zuurstofconcentratie bij de bron oppervlak door het toestel
Evenwicht
1. Kies drie punten op de FOXY dia in om de zuurstofconcentratie te meten.
2. Onmiddellijk na het vastleggen van een eerste beeld bij omgevingstemperatuur zuurstofgehalte, opent de precisie debietregelaar aan gasstroom te starten in het apparaat. Maak foto's op een passend interval om de duur en de omvang van zuurstof Concentr te beoordelenatie evenwicht (bijv. elke 10 seconden gedurende 30 min).

5. Toepassingen

Wound Healing
1. Een dag voor het experiment, geniet van de gesteriliseerde PDMS insert in serum-vrij medium het verminderen van de remmen gasbel vorming in de put.
2. Cultuur cellen om 100% confluentie in een 6-wells plaat.
3. Maak een rechte krassen in de monolagen met een P200 pipet tip om wonden te simuleren.
4. Aspireren de cel media, spoelen met 5 ml media, en zuig opnieuw. Het is belangrijk om niet te storen de monolaag van cellen.
5. Vul de putten met 4 ml serum-vrij medium tot celproliferatie te verminderen.
6. Plaats in te voegen in de putten en sluit elke well met een corresponderende zuurstofconcentratie.
7. Plaats 6-well plaat met insert op verwarmde het podium bij 37 ° C.
8. Capture time lapse beelden van de cellen op de gewenste interval en de totale duur. MATLAB is T_Scratch, een wond te meten algoritme, kunnen worden gebruikt om het genezen oppervlakte te analyseren.

6. Representatieve resultaten

Apparaat validatie
De hypoxische insert apparaat vertoont grote verbeteringen in de hypoxische kamer in termen van zuurstof equilibratietijd en de omvang, waarvoor minder dan 2 minuten te stabiliseren tot 0,5% zuurstof. Het apparaat membraan-en onderkant verkleiningsapparatuur was de kritische factor bij het bepalen van evenwicht efficiency, met een grotere kloof maten die meer tijd tot de steady-state zuurstofconcentratie waarden te bereiken. Het apparaat staat ook een groot deel van de controle over de ruimtelijke oxygenatie in een goed, waardoor de vorming van meerdere voorwaarden, en zelfs het genereren van een cyclisch zuurstof profiel over het oppervlak van de put.
Wondgenezing
Celmonolagen werden blootgesteld aan 10% of 21% zuurstof en de oppervlakte van de wond werd geanalyseerd in de tijd. Krassen worden blootgesteld aan 21% zuurstof sloot de langzaamste en 10% van de snelste. Figuur 1 toont beelden van een kras in de loop van 17 uur. De grafieken in figuur 5 tonen het percentage van de open wond gebied voor zowel de zuurstof-concentraties voor de duur van het experiment.

Figuur 1. Schema en diagrammen functies van het apparaat. De zuurstof insert apparaat wordt gefabriceerd door conventionele fotolithografie (microfluïdisch netwerk), replica gieten (microfluïdisch netwerk en insert steiger), en gedefinieerd spinnen van PDMS (gas-permeabel membraan). A) De zuurstof-apparaat geneste in een 6-wells plaat. B) Voorbeelden van 24 en 96-well pijler arrays. C) Een dwarsdoorsnede schema van een pijler. Zuurstof stroomt in het apparaat via de inlaat en reist over een microfluïdisch netwerk aan de onderkant van de pilaar. Zuurstof kan vrijelijk diffunderen over het gas-permeabel membraan PDMS aan de onderkant van de pilaar en oplossen in de cultuur media. D) Een microscoop afbeelding met de verschillende functies van een single-channel pijler van boven, met een verlijmde glazen posten voor het evenwicht studies.

Figuur 2. Validatie van het apparaat met zuurstof sensoren. Zuurstofspanning in elk putje werd gekarakteriseerd met behulp van een vlakke ruthenium zuurstofsensor. Alle zuurstof mengsels bevatten evenwichtige stikstof en 5% CO ₂ voor media buffering. A) Plot ter illustratie van het effect van post hoogte, en dus zuurstof diffusie afstand tussen het membraan en cellen, op de equilibratietijd en effectiviteit. Hoogten zijn vastgesteld door geslepen glas berichten gebonden aan de onderkant van het apparaat. Alle drie de plaatsen maten leveren evenwicht keer zoveel verbeterd ten opzichte van de hypoxische kamer. Merk op dat de tijd is op een log schaal. B) Plot beeltenis van de snelle zuurstof equilibratietijd responstijd van de 0,2 mm gat apparaat. C) Multi-positie linescans werden ook genomen over de goed onder de microchannel om de homogeniteit van de zuurstofconcentratie geïntroduceerd door het apparaat te verzekeren. Grafiek toont de zuurstofconcentratie gemeten na infusie 0%, 10%, en 21% zuurstof gedurende 10 minuten. D) apparaat wordt effectief 10% zuurstof gedurende 5 dagen.

Figuur 3. Experimenteren met meer complexe zuurstof microkanaal ontwerpen. A) Dual-conditie microkanaal setup levert een stabiel 0% en 21% zuurstof profiel over 14 dagen. B) Een interdigitated en kronkelende patroon van 500 micrometer breed microkanalen zich uitstrekt over ee pijler resulteert in een cyclische zuurstof profiel. Merk op dat de gegevens slechts een vertegenwoordiger trial toont als microkanaal uitlijning was moeilijk.

Figuur 4. Timelapse beelden van wondsluiting 0, 7 en 17 uur na de eerste scratch. Cellen werden geleverd 21% zuurstof gedurende de duur van het experiment.

Figuur 5. Effect van de zuurstofconcentratie op wondgenezing tarief in een scratch assay.

Discussion

Het apparaat wordt gefabriceerd door standaard SU-8 fotolithografie, replica gieten, en gedefinieerde spinnen en geheel gemaakt van polydimethylsiloxaan. Gas wordt ingevoerd in het apparaat tot een concentratie gradiënt tussen de pilaar microchannel en de cultuur media vast te stellen, het besturen van de systeem naar een gewenste evenwicht zuurstofconcentratie. Het apparaat is aangetoond dat het effectief moduleren van de temporele en ruimtelijke zuurstof binnen in een goed, evenals moduleren cellulaire gedrag gepast. De ruimtelijke patronen van de oxygenatie wordt bepaald door de microchannel aan de voet van de zuil, waardoor een verscheidenheid van ontwerpen kunnen worden uitgevoerd in het vervaardigen van het fotomasker. Daarnaast wordt infusie van het gewenste gas in de gas-fase van het goed zal naar verwachting equilibratietijd en de mate van hypoxie te verbeteren. Een microfluïdische het mengen van het netwerk zou kunnen worden aangepast om het apparaat om een middel te bieden om nieuwe gasmengsels te produceren uit slechts een paar voorraad gas tanks. Ten slotte zou een mechanisme voor het media-uitwisseling elimineren de noodzaak voor het verwijderen van het toestel van de multiwell-plaat, waarvan de cellen kunnen reageren.

Het apparaat heeft toepassingen in een in vitro of ex vivo experiment waarbij de controle over zuurstofconcentratie. Als zuurstof is een belangrijke fysiologische variabele die een overgrote meerderheid van de signaalwegen, is op het gebied van onderzoek dat ten goede zou komen beperkt door de creativiteit van de onderzoeker. Sommige gebieden die zouden profiteren van de verbeterde tijdelijke controle van de zuurstofconcentratie onder meer kanker metastase, slaapapneu en cardiale ischemie-reperfusie schade, onder vele anderen. Zo heeft intermitterende hypoxie gecorreleerd met meer invasieve kankers, opregulerende een aantal metastastis-geassocieerde genen ten opzichte van continue hypoxie en normoxia. Ruimtelijke controle is ook belangrijk, zoals zuurstof hellingen zijn van cruciaal belang in de ontwikkeling, de lever zonering, drugs toxiciteit, en de stamcel niche. Het apparaat in dit artikel ten goede zal komen een aantal gebieden van onderzoek door middel van een systeem met een kleinere footprint lab, relatief eenvoudige operationele vereisten, en veel meer controle over de zuurstof blootstelling aan cellen.

Acknowledgments

Dit project werd gefinancierd door de Illinois Department of Public Health en de National Science Foundation (DBI-0852416).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planar FOXY sensor	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gas	Airgas	Custom mixes	All have 5% CO₂
SU-8 2150	MicroChem Corp.
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine	SAFC Global	M3803
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513