Summary
Дрозофилы гемоциты расходиться по совокупности развивающегося эмбриона. Этот протокол демонстрирует, как монтировать и изображение этих миграций использованием эмбрионов с флуоресцентно меченных гемоциты.
Abstract
Многие адреса исследования миграции клеток использованием
Protocol
Подготовка
- Получить соответствующие линии дрозофилы содержащие гемоцитов конкретных Gal4 драйверов (например, SRP-Gal4 2) и генетически закодированы флуоресцентные репортер под UAS контроля (например, UAS-GFP). Мухи гомозиготных по SRP-Gal4, UA-GMA 3 или CRQ-Gal4, UA-GFP 4, 5, особенно полезны для работы с изображениями целей (NB ГОМС GFP, слитый с актин-связывающий домен moesin), см. ниже для обсуждения диапазон Gal4 водителей и UAS конструкции имеется (Блумингтон сток центр содержит широкий спектр).
- Как правило генетических кресты проводятся так, что мутантные аллели были сбалансированы с помощью флуоресцентного балансиры КТГ или ТТГ 6, с Gal4 водителей и UAS конструкций осуществляется по альтернативным гомологичных хромосом. Это дает возможность выбрать гомозиготных мутантов на основе отсутствия КТГ / TTG-связанных GFP флуоресценции (это делается на стадии 2,11).
- Amplify акции и место летит в прокладке клетку с агар яблочный сок пластины 7. Мух нужно как минимум два дня, чтобы акклиматизироваться к укладке клетке перед достаточно эмбрионы начинают укладывать. В целом двадцать мух каждого пола должно быть достаточным для создания эмбрионов достаточно для работы с изображениями, но следует отметить, что различные линии имеют различную степень плодородия. Мы используем 55 мм чашки Петри, которые вписываются в нижней части пластмассовых стаканчиков, проколотые на ее базе, чтобы поток воздуха. Точные средства эмбриона коллекция не имеет значения, но тайминги имеют решающее значение для того, чтобы собрать правильно поставил эмбрионов.
- Сбор эмбрионов из яблочного сока ночь агар пластины поддерживается на уровне 25 ° C или от приурочен пластины. Для последних мы обычно разрешаем мухи лежать на подогретого пластины в течение 4 часов, прежде чем снимать плиты и поместив его на 18 ° С в течение 15-16 часов до монтажа эмбрионов, что обеспечивает эмбрионы из поздней стадии с 12 по на этапе 15 развития. Ночь пластина содержит большее разнообразие этапов, но имеет то преимущество, более высокие уровни флуоресцентного выражение репортером в гемоциты из-за более длительного периода времени при температуре 25 ° С, как Gal4-UAS система чувствительна к температуре.
Процедура
- Выбить эмбрионов из агар яблочный сок пластины с использованием небольшого количества воды и мягкими наконечниками кисти. Вытеснены эмбрионы могут быть легко видеть невооруженным глазом.
- Трансфер эмбрионов в ячейку фильтра (Fisher), либо самодельные корзины 7, поливая водой из агар пластины яблочного сока в корзину, проведенных за стакан для сбора сточных вод.
- Повторите шаг 2,2 пока не будете удовлетворены у вас достаточно эмбрионов из агар пластины яблочного сока.
- Вымойте эмбрионов в сито клеток / корзина с использованием воды.
- Место ячейки фильтра / корзины в крышку чашки Петри с агаром пластины яблочный сок и добавить достаточно аккуратные отбеливателя приостановить эмбрионов в сито клеток / корзину.
- Следуйте dechorionation из эмбрионов на рассечение под микроскопом светлое: dechorionation считается завершенным, когда спинные придатки развели, которое должно произойти в течение двух минут.
- Удалить ячейки фильтра / корзину с эмбрионы из отбеливателя и смыть остаточных отбеливателя с использованием воды. Все следы отбеливателя должны быть удалены прежде чем перейти к шагу 2.8. Один из трюков, чтобы оценить, насколько все отбеливателем был удален это пятно от остаточной воды на голубой цвета тканей лаборатории - при наличии остаточных отбеливателя синий цвет будет беленой белый / розовый.
- Пятно от оставшейся воды с использованием ткани лаборатории / mediwipes применяться к нижней части ячейки фильтра / корзину.
- Место капли воды в крышку чашки Петри. С тонкой кистью, собрать все dechorionated эмбрионов из эмбриона корзину и ресуспендирования их в капли. Следующая сухой эмбрионов путем аспирационной воды с помощью микропипетки или тщательно поглощая его с тканью лаборатории / mediwipes.
- Как только эмбрионы были сушеные, добавить каплю voltalef нефти, чтобы покрыть все эмбрионы. Положите вторую небольшую каплю масла, прилегающих к капле содержащих эмбрионы. NB мы не смогли найти британского поставщика нефти voltalef; галоидоуглеводородов нефти 700 (Sigma), могут быть использованы вместо.
- Под флуоресцентного микроскопа рассечение выбрать надлежащим поставил эмбрионы желаемого генотипа с помощью пары часовщики щипцы (№ 5) от нефти капли. Эти щипцы должны быть согнуты внутрь (рис. 1) для того, чтобы зачерпнуть эмбрионов, не прокалывая своим желточной мембраны. Передача выбранного эмбрионов на второй капли масла. Важно, что вы можете видеть флуоресцентные гемоциты на вскрытии микроскоп, чтобы иметь возможность собирать хорошие изображения по конфокальной микроскопии (рис. 2). Как правило, мы монтировать этап 13/14 эмбрионов изображение латеральной миграции гемоцитов на брюшной средней линии или стадии 15 эмбрионовв изображение моторику гемоциты следующем разгоне более эмбриона.
- Придерживайтесь два покровных (18x18mm, толщина 1) к нижней Petriperm / Lumox блюдо (Sarstedt), используя 2 маленьких капель масла voltalef, оставив примерно 1 см между ними (рис. 3), они будут использованы для поддержки покровное находиться над эмбрионов, чтобы не раздавить их. Petriperm блюд (диаметр 50мм) содержат гидрофобные, газ-мембрана. Мы считаем, что блюда стали проще в использовании, как только они были использованы несколько раз (блюда можно протирать 70% этанола и повторно использовать).
- В светлое на вскрытии микроскоп, забрать выбранный эмбрионов один за другим с изогнутым пинцетом и линии их брюшной стороне и параллельно краю покровные (рис. 3). Вполне возможно, для выравнивания до 15 эмбрионов, таким образом, в зависимости от вашего ловкость и терпение. Важно, чтобы манипулировать эмбрионы мягко и как эмбрионы и мембраны Petriperm блюдо очень хрупкие и легко может быть разрыв.
- Как только эмбрионы выравниваются добавить каплю масла и дайте ему распространиться на форму однородного слоя между двумя покровные. После масла распространилась (это может занять несколько минут), убедитесь, что эмбрионы еще вентральной стороной вверх. Если эмбрионы проката незначительно, изменить их снова с щипцами.
- Наконец, используя пинцет (номер 3) место покровное (18x18mm, толщина 1) над эмбрионами, опираясь на две ранее придерживался покровные. Клей этого покровное к покровным поддерживает использование лака для ногтей (рис. 3).
- Возьмите Petriperm блюдо с установленными эмбрионов для конфокальной или широким полем зрения микроскопа и смонтировать Petriperm блюдо на сцене с помощью соответствующего адаптера. Либо вертикальном или перевернутом микроскоп может быть использован с целью фокусировки объектива через покровное (а не через мембрану).
Представитель Результат:
Этот протокол описывает, как монтировать дрозофилы эмбрионов для живого изображения гемоцитов на брюшной стороне зародыша. Если все сделано правильно, это будет легко для создания либо фотографий или фильмов гемоцитов. Основным фактором, определяющим является микроскоп используется для изображения гемоциты (в частности объектива), но характер изображений, полученных будет также зависеть от стадии развития, температуры эмбрионы были подняты на и Gal4 и UAS линий используются.
Более высокие уровни экспрессии белка люминесцентные позволит гемоциты для включения в образ с большей легкостью, поэтому важно, чтобы быть в состоянии видеть гемоциты, когда эмбрионы на стадии 2,11 протокола (рис. 2 содержит примеры ясно гемоциты в эмбрионы, взятые с Камера установлена на вскрытии микроскопом). Поэтому увеличение числа Gal4 и UAS конструкции позволяют большее отношение сигнал-шум. Кроме того это снижает потребность в высокой интенсивности лазерного излучения или увеличения времени экспозиции при изображении, которая, в свою очередь, позволяет гемоцитов поведения, которым необходимо следовать в течение более длительного времени.
Очень высокий уровень экспрессии GFP появятся мелкие детали морфологии гемоцитов, особенно тонкий лист типа ламелей, которые окружают круговой тела клетки (рис. 4A-B). Циркуляр регионах исключая GFP представляет фагосом (Рис. 4A-C). Finger-подобные филоподий также можно увидеть выходящим из ламелей (рис. 4В). Два Gal4 водители остаются достаточно, чтобы увидеть эти процессы (рис. 4С), особенно если один или более SRP-Gal4 (см. обсуждение), однако медленнее скорости сканирования или больше мощности лазера по конфокальной микроскопии могут быть необходимы. Как уровни экспрессии уменьшить его становится все труднее изображения выступов гемоцитов, тем не менее он по-прежнему можно проследить миграцию гемоцитов в этих условиях, как клетка тела остается очевидным даже тогда, когда выступы менее ясны (см. рис 4D).
На ранних стадиях развития (до стадии 13) гемоциты мигрировать в тесном контакте друг с другом, и это часто бывает трудно различить отдельные клетки. К концу этапа 13 гемоциты образовали одну линию вниз вентральной срединной линии (рис. 5А), то, становясь все более подвижны, мигрируют латерально к краям брюшной нервной цепочки (рис. 5B). Актина цитоскелета в динамическом выступы гемоцитов могут быть непосредственно наблюдать через выражение GMA (рис. 5С) или вишневого moesin.
Монтаж эмбрионов, таким образом, позволяет газообмена, предотвращает обезвоживание и эмбрионы сохраняют жизнеспособность следующих изображений. Если эмбрион был поврежден во время монтажа она, как правило, очевидны, как эмбрион содержание будет течь через его желточной оболочки. Если эмбрион действительно начинается для обезвоживания, то это может часто видели деформаций в желточной оболочки. Иногда эмбрион будет катиться в ходе timelapse кино, однако это только, как правило, проблематично для более длинных сроков фильмов. Lastlу, монтаж нескольких эмбрионов одновременно дает экспериментатор лучшие шансы на получение эмбриона в идеальной ориентации для своего эксперимента.
Рисунок 1. Пинцет для манипуляции dechorionated эмбрионов.
Кончики щипцов часовщиков (размер № 5) должны быть согнуты внутрь, чтобы мода инструмент, чтобы зачерпнуть эмбрионов, как показано здесь. Наружная поверхность согнуты региона также полезна для управления эмбрионов при позиционировании на Petriperm мембраны, поскольку они не обладают острыми краями, которые могли бы прокол эмбриона.
Рисунок 2. Представитель изображения эмбрионов, которые дают хорошие результаты жить изображений.
Изображения dechorionated эмбрионов на нефть voltalef (на стадии 2,11 протокола), взятые на флуоресцентные рассекает микроскопом. Боковой вид этапе 13 (А) и стадии 15 (В) SRP-Gal4, UA-GFP; CRQ-Gal4, UA-GFP эмбрионов. Боковой вид этап 15 SRP-Gal4, UA-GFP / +; CRQ-Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac эмбриона (C), в котором гемоциты не смогли мигрировать из головы, демонстрируя то, что эмбрионы выглядеть, когда гемоциты не очевидны на их миграционном маршруте. Боковой вид стадия 17 SRP-Gal4, UA-GFP; CRQ-Gal4, UA-GFP эмбрион показывает запутанная структура кишки на данном этапе развития (D); начала сокращения мышц мешает жить изображения эмбрионов вне этого стадии развития. Брюшной видом стадии 13 (E) и на стадии 14 (F) SRP-Gal4, UA-красный жало эмбрионов показывает разгон гемоциты с флуоресцентно меченых ядер. Наблюдение гемоциты флуоресцентной на стадии 2,11 протокола является обязательным условием для получения превосходные изображения, на переднем это право для всех изображений.
Рисунок 3. Монтаж эмбрионов на Petriperm / Lumox блюдо.
Два 18x18mm покровные (толщина 1) привязаны к нижней поверхности Petriperm блюдо с помощью небольшой капли масла, разделенных примерно на 1 см, как показано на рисунке. Эмбрионы затем выстроились брюшной стороне с их длинными (передне-задней) оси, параллельной края покровных и покрыты небольшую каплю масла. Как только нефть распространилась, чтобы заполнить пробел между двумя покровные 1 / 3 покровное (18x18mm толщиной 1), аккуратно укладывать поверх масла покрытые эмбрионы, используя два ранее придерживался покровных в качестве моста, чтобы предотвратить эмбрионов от сжато. Это покровное затем приклеивается к покровным два моста с помощью двух небольших капель лака для ногтей. После установки, эмбрионы могут быть отображены на вертикальном или перевернутом микроскоп с фокусировки объектива вниз через покровное (а не через Petriperm мембраны).
Рисунок 4. Представитель результатов от живых изображений GFP помечены гемоциты.
Z-проекции гемоциты на брюшной стороне этапе 14 SRP-Gal4, UA-GFP; CRQ-Gal4, UA-GFP эмбриона (АВ). (А) меньшее увеличение изображения, например, использоваться для мониторинга гемоцитов развития миграций в timelapse фильмов. (В) еще большем увеличении гемоцитов на брюшной средней линии, показывая мелкие детали их морфологии. (С) 1 м один ломтик гемоциты на вентральной срединной линии в стадии 14 SRP-Gal4, UA-GFP / +; CRQ-Gal4, UA-GFP / + эмбриона, показывая, что ниже копия числа Gal4 водителей и UAS конструкций и достаточны для создания хороших изображений. (D) отображает г-проектирования гемоцитов в стадии 14-CRQ Gal4, UA-GFP эмбриона. Здесь гемоцитов выступы менее очевидны в связи со снижением экспрессии GFP, но это еще можно снимать фильмы и отслеживать гемоцитов миграции с таким сочетанием Gal4 водителя и UAS конструкции. Изображения были приняты на Leica LSM510 конфокальной микроскопии, на переднем является во всех изображений; кольца на периферии изображения вызваны аутофлюоресценция желточной оболочки.
Рисунок 5. Представитель результатов от живых изображений GMA выражения гемоциты.
Z-проекции гемоциты на брюшной средней линии этапе 13 (А) и стадии 14 (В) SRP-Gal4, UA-GMA эмбрионов, взятых из timelapse фильмы, чтобы показать развитие миграции гемоцитов. Подробная информация о актина динамики может быть получена большем увеличении изображений GMA выражения гемоциты (С). GMA состоит из GFP, слитый с актин-связывающим доменом нитей moesin и этикетки актина. Передняя находится во всех изображений; снимки были сделаны по конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшими элементами этой процедуры выбора здоровых эмбрионов с четкой маркировкой гемоциты и монтировать их тщательно, не повреждая их. Как только эмбрионы в галоидоуглеводородов нефти они устойчивы к обезвоживанию и как только установлен могут быть отображены на несколько часов. В наших руках, мы можем изображение гемоциты течение трех часов, с незначительным обезвоживанием эмбриона или очевидные фото-повреждения, с Z-Stack изображений каждые три минуты на нашем Zeiss LSM510 конфокальной микроскопии с 40X цели. С гемоциты являются очень динамичной могут компромисс между пространственным и временным разрешением: если очень высоким разрешением изображения необходима гемоцитов и сооружений в ней может двигаться во время сканирования. Точные детали того, как изображения впоследствии собраны будет определяться экспериментальные вопросы решать.
Обычно мы используем UAS-GFP или UAS-GMA 3 до этикетке гемоциты; UAS-GMA особенно полезно, поскольку, в дополнение к маркировке гемоциты, она обеспечивает считывание актиновых филаментов динамики. Другие конструкции UAS может быть использована для исследования поведения гемоцитов: например UAS-вишневый конструкций 9 может быть использован как альтернатива флуорофоров или UAS-тау-GFP 10 может использоваться для визуализации микротрубочек в гемоцитов. UAS конструкций с ядерными этикетке могут быть особенно ценными для автоматического отслеживания гемоцитов движений (рис. 2Е-F). Двухцветные изображения также возможно (например, один может маркировать как актина и микротрубочек цитоскелетов использовании UAS-вишневого moesin и UAS-тау-GFP, соответственно, под контролем гемоцитов конкретных Gal4 водителя). Как упоминалось ранее, ключевым фактором, определяющим в живых изображений гемоцитов является Gal4 водитель занятых: с точки зрения текущих гемоцитов конкретных промоутеров SRP-Gal4 2> CRQ-Gal4 11> Рхп-Gal4 4, только с SRP-Gal4 достаточно этикетке гемоциты когда гетерозиготные, тогда как по крайней мере в двух экземплярах CRQ-Gal4 или Рхп-Gal4 необходимо соблюдать гемоциты жить. Тем не менее оптимального изображения с SRP-Gal4 требует гомозиготности (или наличие альтернативных Gal4 водителя).
Следуя гемоциты жить в этом пути можно изучать их развития, разгон с главой 8 и наблюдать, как они взаимодействуют с реплики, которые картина этого процесса, депозитные матрицы и поглотить апоптоза трупов. Гемоциты также представляют интересную систему, с которой для исследования механизмов миграции клеток, путем изучения миграции гемоцитов в эмбрионах, которые испытывают недостаток компонентов актина и микротрубочек цитоскелетов можно понять их в естественных условиях функционировать более четко (например, Ро ГТФаз 4, 12). Эксплуатация UAS конструкции для обозначения этих цитоскелетов предоставляет еще более подробную информацию об их регулировании.
Мы модифицировали эту методику для исследования гемоцитов поведения в различных ситуациях, таких как свои ответы на лазерно-индуцированной wounds4 и нагнетательных флуоресцентно меченных бактерий 13. Кроме того этот метод может быть легко адаптирована для изображения других типов клеток, выбирая различные Gal4 водителей. Например, мы ранее отображаемого спинной закрытия использованием эпителиальных Gal4 драйверов 14, 15. Применение этого метода для других типов клеток ограничено сила Gal4 водителя, положение клетки для включения в образ внутри эмбриона и тип микроскопа для визуализации; многофотонной конфокальные микроскопы позволяют пользователю образ поведения клеток глубоких внутри эмбриона (например, половых клеток трансэпителиальная миграции 16), в то время как обычные конфокальной микроскопы не могут добраться до этих глубин (именно поэтому мы картинку под вентральной средней линии, где гемоциты очень поверхностны, в ловушке между развивающимися брюшной нервной и эпидермиса).
Сила этого протокола является то, что она обеспечивает условия для поддержания эмбрионов в здоровое состояние для живого изображения. Хотя степень ловкости рук требуется положение эмбриона, это легко освоить технику и быстро дает воспроизводимые результаты и может быть легко изменен с помощью различных Gal4 водителей и UAS конструкции, чтобы исследовать различные аспекты гемоцитов биологии. Кроме того, протокол не ограничивается гемоциты с использованием альтернативных Gal4 драйверов позволяет поведение других типов тканей для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот протокол был разработан благодаря нашей работе внутри, так и в сотрудничестве с лабораториями Пол Мартин и Антонио Хасинто. Мы благодарим Центр Блумингтон фондовую его отличный сервис и сообщества дрозофилы для продолжения поделиться летать линий. БС в настоящее время финансируется СИББН грантового проекта. WW финансируется Карьера Wellcome стипендий фонда развития.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70μm pores |
| Halcarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt Ltd | 96077305 |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
