Summary
מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.
Abstract
חשיבות ביולוגית קליניים היסוד של חלבונים בממברנה נפרד מתבקש הפיתוח של מערכת שמרים מבוססי זיהוי תפוקה גבוהה של חלבונים אינטראקציות (PPI) עבור באורך מלא חלבונים הטרנסממברני. לשם כך, פיתח את המעבדה שלנו שמרים מפוצל היוביקוויטין ממברנה המבוססת שני היברידי (מיתוס) של המערכת. טכנולוגיה זו מאפשרת לגילוי רגיש של אינטראקציות חלבון חולף ויציבה באמצעות
Protocol
1. רקע מידע
חלבון אינטראקציות חלבון (PPIS) הם אבני הבניין הבסיסיות מעורב השולטים בכל תהליכים תאיים. כתוצאה מכך, זה הכרחי כי כל האינטראקציות מוסדרים היטב על מנת לשמור על הומאוסטזיס הסלולר, כמו שינוי האיזון הביולוגי הזה בדרך כלל תפקיד מחלות סרטן תא שינוי. ממברנה חלבונים הקשורים הן בקרב המעמד החשוב ביותר מבחינה ביולוגית של חלבונים שהם יכולים ליזום מפלי איתות מורכבת, לתווך הן את היבוא והיצוא של מולקולות שונות, כולל תרופות, אשר כבר משמעות האחרונות בתחום הבריאות כמו בעיות הקשורות עמידות לתרופות הפכו נפוצים יותר ויותר. השגת תובנה לגבי המורכבות של המעמד הזה חלבון דורש זיהוי של השותפים באינטראקציה שלהם. גילוי שותפים כאלה הוכיחה מאתגר, לעיתים קרובות זה דורש בתנאים קשים שיש אופטימיזציה עבור כל חלבון מחויב קרום [1].
חשיבות ביולוגית קליניים היסוד של חלבונים בממברנה נפרד מתבקש הפיתוח של מערכת שמרים מבוססי זיהוי תפוקה גבוהה של מדד המחירים ליצרן עבור באורך מלא חלבונים הטרנסממברני. לשם כך, פיתחנו את שמרים מפוצל היוביקוויטין ממברנה המבוססת שני היברידי (מיתוס) מערכת [2-4]. כלי זה מאפשר לגילוי רגיש של אינטראקציות חלבון חולף ויציבה. זה כבר מיושם בהצלחה במחקר חלבונים אקסוגניים ו אנדוגני לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces [3-7]. מיתוס מנצל התצפית כי היוביקוויטין ניתן להפריד לשתי moieties:. חצי בטרמינל C-(C UB) ואת החצי N-מסוף (NubI) במחקרים vivo הראו כי אלה moieties ספונטני מחדש עקב זיקה גבוהה שלהם אחד אחר (Figure. 1a). עם זאת, מציגה isoleucine 13 עד מוטציה נקודתית גליצין במחצית N-הטרמינל של היוביקוויטין (הפקת שבר המכונה N UB G) זה מונע ספונטנית מחדש העמותה [8] (1b Figure.).
אנו עושים שימוש בעקרון זה במערכת מיתוס (Figure. 1c ו - 2). בקצרה, חלבון אינטגרלי בממברנה הפיתיון הוא התמזגו מחצית C UB אשר קשורה גורם שעתוק מלאכותי המורכב של Escherichia coli-DNA מחייבת חלבון LexA ואת תחום הפעלת VP16 של וירוס הרפס סימפלקס. פושט נוצרים על ידי איחוי של שברי דנ"א או cDNA גנומי נגזר על מחצית NubG. האינטראקציה בין הפיתיון וחלבונים טרף שורה שמרים מוביל הכינון מחדש של מולקולת "פסאודו היוביקוויטין" באורך מלא, עם הכרה לאחר מכן על ידי אנזימים deubiquitinating cytosolic (dubs) ולשחרר פרוטאוליטי של גורם שעתוק. גורם שעתוק יכולים להיכנס לגרעין התא, ולהפעיל את הגן כתב המערכת (בדרך כלל מעורבים ביטוי HIS3, lacZ וגנים ADE2) המאפשר גידול של זני שמרים על התקשורת סלקטיבית, אשר מעיד על הפיתיון ואת האינטראקציה טרף [ 2-4].
זיהוי ואפיון של אינטראקציות חלבון אינטגרלי בממברנה יספק מידע כדי לעזור להבין את תפקידם. ככל שאנו יותר נכון להבין לנתח את תפקידם של חלבונים אינטראקציה עם חלבונים בממברנה אינטגרלי, אנו עשויים לקבל תובנה הגומלין דינמי המעורבים בוויסות החלבונים האלה ולגלות מטרות רומן שייתכן הפוטנציאל הטיפולי.
2. מבחר פיתיון מערכת מיתוס הולמת
- לפני ביצוע ניתוח מיתוס, ודא כי החלבון שלך יש N-ו / או C-הסופית שלה ב cytosol של התא. זה חיוני כי תג UB-LexA-VP16 C להיות התמזגו חלבון שלכם בתחנה הסופית כזה, שכן האנזימים deubiquitinating הכרחי לשחרור גורם שעתוק נמצאים cytosol [4].
- לאחר מכן, להחליט איזו משתי הגרסאות העיקריות של מיתוס מתאים. במשך שאינם ילידי חלבונים שמרים, מיתוס המסורתית (tMYTH) עשוי לשמש, שבו הם פיתיונות overexpressed ectopically מתוך פלסמיד. עבור חלבונים שמרים הילידים, מיתוס משולב (iMYTH) היא השיטה של בחירה. ב iMYTH פיתיונות מתויגים endogenously עם תג ה-C-UB LexA-VP16, להשאיר אותם תחת שליטה של האמרגן האם שלהם. זהו יתרון, שכן רמת wild-type הביטוי של פיתיונות עוזר למנוע בעיות הקשורות overexpression חלבון, כגון מספר מוגבר של תוצאות חיוביות שגויות [3]. למעט בנייה הפיתיון הראשוני בתקשורת סלקטיביים בשימוש, הן צורות של מיתוס מתבצעות באופן זהה. לשם הבהירות, אנו נתמקד בעיקר על השימוש tMYTH בדוח זה, כמו זה וריאנט יכול, באופן עקרוני, ניתן להשתמש עם חלבונים בממברנה של כל אורגניזם כמעט והואוכך נרחב יותר ישים.
3. פיתיון הדור אימות
- Media חובה ופתרונות
- סטרילי DDH 2 O שהכין מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- 3-amino-1-,2,4 triazole (3-AT) פתרון מוכן כפתרון מניות 1M ב DDH 2 O. לעקר ע"י מעבר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
- YPAD מדיה צמיחה בהיקף של 1 לחלץ w / v שמרים%, 2% w / v peptone, 2% w / v גלוקוז 100 מיקרומטר אדנין שהוכנו DDH 2 O. לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- 10x אמינו חומצה / מערבבים מאגר נוקלאוטיד: תמהיל מלא מכיל 1.0 מ"מ אדנין, אורציל 1.8 מ"מ, 1.0 מ"מ ארגינין, היסטידין 1.0 מ"מ, 2.3 מ"מ isoleucine, 7.6 mM לאוצין, ליזין 1.6 mM, 10.1 mM מתיונין, פנילאלנין 3.0 mM, 16.8 mM תראונין, טריפטופן 2.0 מ"מ, 1.7 מ"מ ו טירוזין valine mM 12.8, שהוכנו DDH 2 O. לגבי הנשירה להשמיט את חומצת אמינו הדרושים (ים) ו / או בסיס נוקלאוטיד (ים). לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- סינתטי הנשירה (SD) מדיה צמיחה בהיקף של 0.67% w / v חנקן בסיס שמרים (ללא חומצות אמינו אך עם אמוניום סולפט), 2% w / v גלוקוז, 2% w / v אגר ו 1x מערבבים חומצה אמינו / נוקלאוטיד, הוכן DDH 2 O. הכן שני נוזלים ומוצקים (המכיל אגר 2%) SD-leucine התקשורת. כמו כן להכין מוצק SD-טריפטופן, לאוצין ו SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין התקשורת. לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות. יוצקים לתוך כלי התקשורת מוצק מ"מ 100x15 פטרי.
- סינתטי הנשירה (SD) צמיחה Media מכיל 3-AT. הכן SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין התקשורת כפי שתואר, אך המכיל 3-AT בריכוזים של 25, 50, 75 ו - 100 מ"מ. הוסף את הכמות המתאימה של 3-AT מפתרון מניות 1M הסטרילי לתקשורת לאחר שהוא autoclaved ומקורר (אך לא התגבש עדיין). יוצקים לצלחות פטרי 100x15 מ"מ.
- PEG / ליתיום אצטט מערבבים בהיקף של 40% w / v-PEG 3350, 120 ליתיום mM Acetate ו 167 מיקרוגרם / מ"ל סלמון זרע DNA (Type III מלח נתרן) שהוכנו DDH 2 O. על מנת להבטיח את סטריליות של תערובת זו להכין אותו מן המים ופתרונות סטרילי (autoclaved כלומר 50% PEG-3350, autoclaved Acetate ליתיום 1M ו - 2 מ"ג / מ"ל זרע סלמון DNA סוג III מלח נתרן שהוכנו סטרילי DDH 2 O).
- האנזים ריאגנטים לביצוע PCR.
- ערכת miniprep מסחרי.
- סודה לימון חרוזי זכוכית (0.5 מ"מ).
- Escherichia coli המוסמכת תאים מתאים התפשטות פלסמיד (למשל DH5α, XL10 זהב) ואת התקשורת תקן מתאים התפשטות חיידקים מבחר פלסמיד.
- שמרים זנים ספציפיים, פלסמידים primers כמתואר בפרוטוקול.
- הדור של פיתיונות tMYTH על ידי תיקון גאפ
- הפיתיון חייב להיות משובטים לתוך וקטור מתאים תיוג הביטוי. מגוון של וקטורים tMYTH כרגע זמינים לשימוש בנייה הפיתיון. וקטור כגון pCMBV4, pAMBV4 ו pTMBV4 לאפשר בנייה של C-סופני פיתיונות מתויג (הפיתיון C-UB-LexA-VP16) בשליטת CYC1 (חלש), ADH1 (חזק) ו TEF1 (חזק מאוד) היזמים, בהתאמה . פיתיונות מתויג N-סופניים (LexA VP16-C-UB-הפיתיון) ניתן להפיק באמצעות וקטורים כמו pTLB-1 ו-N pBT3, תחת שליטה של TEF1 ו CYC1 היזמים, בהתאמה. הבחירה וקטור תלוי הפיתיון ואת צריכה להיקבע באופן אמפירי. במקרים מסוימים הביטוי הפיתיון גבוה הוא הכרחי על מנת לזהות אינטראקציות, בעוד overexpression במקרים אחרים הפיתיון בפועל עשוי להיות מזיק, המוביל במספר מוגבר של תוצאות חיוביות שגויות.
- הגבלת לעכל את הפלסמיד נבחרים באתר הגבלה המתאים (ים). המחשוף צריך להתרחש רק בסביבה הקרובה של תג ה-C-UB LexA-VP16 (במעלה הזרם של התג עבור תיוג בטרמינל C-או במורד הזרם עבור תיוג N-מסוף). למשל, כאשר באמצעות וקטור pAMBV4, SfiI הוא הבחירה האידיאלית. חנות פלסמיד מתעכל ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.
- עיצוב primers עבור הגברה לבין שיבוט הגן של עניין. 5 "סוף פריימר העבר שלך חייבים להתאים כ 35-40 נוקלאוטידים upstream של אתר הגבלה, בעוד 3" בסוף חייבים להתאים הראשון 18-20 נוקלאוטידים של הגן היעד. 5 "סוף פריימר הפוך חייבים להיות תואמים המשלימים הפוכה של כ 35-40 נוקלאוטידים downstream של אתר הגבלה, עם 3" סוף התאמת משלימים הפוכה של 18-20 נוקלאוטידים האחרון של הגן היעד (השמטת קודון להפסיק אם ה-C-UB LexA-VP16 תג שיוצבו במסוף-C). תלוי אם N-או C-מסוף תיוג מתבצע, בחר 35-40 נוקלאוטידים של פריימר קדימה או היפוך כזה כי הגן היעד הוא משובטים באותה מסגרת עם תג ה-C-UB LexA-VP16.
- להגביר את הגן של הריבית על ידי ה-PCR באמצעות primers לעיל. פרמטרים PCR יהיה תלוי אנזים מסוים פריימרים ספציפיים בשימוש.
- המרה המוצר PCR יחד עם הפלסמיד לתוך מתעכל זן מעבדה המתאים שמרים נושאת מוטציה leu2 (למשל BY4741). עיתונאי מיתוס זן (למשל THY.AP4 או L40) יכול לשמש אך אינו הכרחי, כפי לצורך השמרים בשלב זה היא פשוט לשמש סביבה שבה לתקן פער הומולוגיים רקומבינציה יכולה להתרחש. השינוי צריך להתבצע כדלקמן:
- לחסן מושבה אחת של זן שמרים שבחרת לתוך 5 מ"ל של התקשורת YPAD סטרילית דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רעד קבוע (200 סל"ד).
- לדלל את תרבות הלילה לתוך 50 מ"ל של התקשורת YPAD טריים OD600 של ~ 0.15 ו לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל"ד). לגדול במשך כ 3-4 שעות עד OD600 של ~ 0.6 הוא הגיע.
- צנטריפוגה התאים ב 700xg במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 25 מ"ל סטרילי DDH 2 O ו צנטריפוגות ב 700xg במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל סטרילי DDH 2 O.
- הוספת 100 μL של התאים, 300 לערבב μL PEG / ליתיום Acetate, ואת הפלסמיד מתעכל (50 fmol) ו-PCR המוצר (250-500 fmol) לצינור microfuge.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- מחממים זעזוע 42 ° C למשך שעה 1.
- צנטריפוגה ב 3000xg 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 200 μL סטרילי DDH 2 O ו צלחת נפח כולו על מוצק, SD-leucine התקשורת סלקטיבית. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2-4 ימים.
- תתבגר מושבה אחת של המתח הפך ב 5 מ"ל SD-leucine התקשורת נוזלי 30 ° C במשך הלילה.
- צנטריפוגה תאים ב 700xg במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
- לבודד פלסמיד דנ"א הפיתיון מכדורי התא באמצעות כל ערכת מסחרי miniprep. בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי עם שינוי אחד. על מנת להבטיח תמוגה מספיק תא שמרים, להוסיף נפח קטן של 0.5 מ"מ חרוזי זכוכית סודה לימון על גלולה לאחר resuspension מערבולת הראשוני בתוקף במשך 5 דקות. ואז להמשיך עם פרוטוקול המסחרי כרגיל.
- המרה DNA שמרים מבודדים לתוך E. המוסמכת coli זן מתאים התפשטות פלסמיד (למשל DH5α, XL10 זהב) עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1x10 7 תאים / DNA מיקרוגרם. שים לב פלסמידים הפיתיון ניתן לבחור לשימוש kanamycin.
- קציר פלסמיד דנ"א של E. טרנספורמציה coli באמצעות תקן ה-DNA שיטת בידוד או ערכת מסחרי.
- ודא בנייה נכונה של הפיתיון הפלסמיד על ידי רצף.
- המרה את הפיתיון מאומת לבנות לתוך זן הכתב מתאים מיתוס (למשל THY.AP4, L40). השינוי שמרים פרוטוקול שתוארו לעיל יכולים לשמש, החלפת את ה-DNA פלסמיד פיתיון במקום של המוצר פלסמיד ו PCR מעוכל.
- אימות פיתיון - לוקליזציה פרופר
- לפני השימוש, זנים הפיתיון מנותחים על מנת להבטיח כי הן מקומי כראוי קרום השמרים. בעת שימוש iMYTH, לוקליזציה זה יהיה תלוי בעיקר על המאפיינים של הפיתיון מתויג. עבור tMYTH, פלסמידים פיתיון בדרך כלל כוללים רצף האות (למשל Matα) בימוי החלבון הביע את הממברנה הפלסמטית. לוקליזציה נקבעת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הכללה של מולקולה YFP ברצף תג הפיתיון (כלומר C-UB-YFP LexA-VP16) היא הגישה הישירה והפשוטה ביותר, המאפשר הדמיה ישירה של תאים חיים, אבל הוא נפוץ iMYTH. לחלופין, גישה immunofluorescence תקן באמצעות נוגדנים נגד LexA או VP16 רכיבים של התג ניתן להשתמש.
- אימות פיתיון - N UB G / אני בקרה מבחן
- לוקליזציה הנכון ברגע של הפיתיון כבר נקבעה, יש צורך להבטיח כי הפיתיון לא להפעיל את מערכת הכתב לבד או בנוכחות אי - אינטראקציה פושט (כלומר לוודא כי הפיתיון אינו עצמית הפעלת). מטרה זו מושגת באמצעות UB N G / מבחן אני שם את הפיתיון משתנה עם אינטראקציה (חיובי) ולא אינטראקציה (שלילי) פושט שליטה, צמיחה מוערכת על התקשורת סלקטיבית. הפיתיון חייב לגדול על התקשורת סלקטיבית in נוכחות של שליטה חיובית, ולא לגדול בנוכחות מלאה השלילי, כדי להיות מתאים לשימוש מיתוס.
- בגין, ולהמיר את המתח הפיתיון להיבדק עם ng 100-200 טרף לשלוט פלסמיד. השינוי שתואר לעיל פרוטוקול שמרים יכולים לשמש, החלפת SD-leucine התקשורת במקום YPAD ושימוש SD-טריפטופן, לאוצין התקשורת לשלב ציפוי הסופי. טרף בונה הבאים לשלוט משמשים בדרך כלל:
- pOST1 N-UB אני (בקרה חיובית)
- pOST1 N-UB G (בקרה שלילית)
- pFUR4 N-UB אני (בקרה חיובית)
- pFUR4 N-UB G (בקרה שלילית)
- OST1 הוא מרכיב של המתחם oligosaccharyl והוא ממוקם על הממברנה reticulum endoplasmic [9] תוך FUR4 הוא permease אורציל, והוא ממוקם על קרום התא [10]. למרות החלבונים האלה הם בדרך כלל הבחירה הראשונה שלנו לשימוש ללא אינטראקציה פושט, התאמתם ישתנו על מקרה לגופו. במקרה הלא סביר כי הפיתיון שלך צפוי באמת אינטראקציה עם שני פקדים אלה, פושט אלטרנטיבה יהיה צורך שנבחר. נזכיר כי N אני UB היא הצורה wild-type של התחנה-N של היוביקוויטין, באופן ספונטני אינטראקציה עם C UB עצמאית של אינטראקציה בין חלבונים שאליו UB C ו-N UB הם התמזגו. לפיכך N UB אני פושט מהווים שולטת חיובית, בעוד UB N G פושט (נושאת את isoleucine 13 מוטציה גליצין המונע התאגדות ספונטנית של N ו-C UB UB) לשמש שולטת שלילית.
- Resuspend מושבות אחת של כל פיתיון להפוך 100 μL סטרילי DDH 2 O.
- סדרתי לדלל את התאים resuspended ב סטרילי DDH 2 O לייצר דילולים של 1 / 10, 1 / 100 ו - 1 / 1000.
- ספוט 5 כרכים μL של תאים חי ומדולל על SD-טריפטופן, לאוצין ו SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין התקשורת עם ובלי 3-AT בכל טווח של ריכוזים. 3-AT פועל כמעכב תחרותי של הגן HIS3 הכתב, ומשמש כדי להגדיל את ההחמרה של תהליך הבחירה. זה יכול להיות שימושי במקרים מסוימים לצמיחה עיכוב הלא ספציפית של חלושות אל בינוני עצמית הפעלת פיתיונות.
- אפשר כתמים להתייבש ואז דגירה לוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים.
- Transformants כל צריך לגדול על SD-טריפטופן, לאוצין צלחות, המעיד על כך שהם הפכו טרף בהצלחה עם פלסמיד. פיתיונות אשר לא להפעיל העצמי יגדל ב SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין התקשורת רק כאשר הפך עם N UB אני בונה טרף, ולא עם N UB G פושט. שים לב מה הריכוז של 3-AT נדרש בתקשורת (אם בכלל) כמו זה יהיה צורך בשימוש במהלך ההקרנה.
4. סריקה
- Media חובה ופתרונות
- סטרילי DDH 2 O שהכין מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- הפתרון NaCl 0.9% שהוכנו DDH 2 O ו מעוקרים ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- פוספט נתרן פתרון המורכב נתרן 493 mM פוספט dibasic ו 250 mM נתרן זרחתי monobasic ב DDH 2 O. לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- גל ה-X (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) פתרון מוכן כמו 100 מ"ג / מ"ל פתרון המניות N, N-דימתיל לפוראמיד.
- 2xYPAD מדיה גדילה המכיל 2% w / v תמצית שמרים, 4% w / v peptone, 4% w / v גלוקוז 100 מיקרומטר אדנין, שהוכנו DDH 2 O. לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- סינתטי נשירה (SD) מדיה הצמיחה, הכינו כפי שתואר לעיל. הכינו נוזל SD-leucine מוצק SD-טריפטופן, לאוצין. יוצקים את התקשורת מוצק לתוך שתי צלחות פטרי 100x15 מ"מ. הכן מוצק SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין התקשורת 150 מ"מ לוחות עגולים, 16 צלחות עבור כל מסך, המכיל 3-AT, ובמידת הצורך בריכוז שנקבע מן UB N G / אני מבחן שליטה.
- סינתטי נשירה (SD) מדיה + 5-Bromo-4-כלורו-3-Indoyl-β-D-Galactopyranoside (X-Gal). הכן SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין מדיה המכילה אגר כפי שתואר לעיל. לאחר מעוקר, להתקרר, להוסיף 3-AT (במידת הצורך) ואחריו נפח o 1/10thו סודיום פוספט פתרון סטרילי. לאחר מכן, הוסף X-Gal הפתרון לריכוז סופי של 80 מיקרוגרם / מ"ל. מערבבים היטב ויוצקים לתוך צלחות 150 מ"מ עגול.
- PEG / ליתיום פתרון Acetate II המכיל 40% PEG-3350, סוללת ליתיום 100 mM Acetate, 1 mM EDTA ו - 10 mM טריס pH 7.5. הכן את הפתרון הזה באמצעות סטרילי DDH 2 O פתרונות (למשל autoclaved 50% PEG-3350, 1 Acetate M ליתיום, 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו - 500 mM EDTA pH 8.0).
- ליתיום אצטט / טריס פתרון EDTA המכיל 110 ליתיום mM Acetate, 11 מ"מ טריס pH 7.5 ו - 1.1 mM EDTA. הכן את הפתרון הזה באמצעות סטרילי DDH 2 O פתרונות (למשל autoclaved Acetate ליתיום 1M, 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו - 500 mM EDTA pH 8.0).
- הפתרון 10x טריס EDTA המורכב 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו - 10 mM EDTA שהוכנה DDH 2 O. לעקר ידי מעוקר ב 121 ° C, 15 psi במשך 30 דקות.
- הפתרון גדילי דנ"א יחיד Carrier (ssDNA) המכיל 2 מ"ג / מ"ל זרע סלמון DNA סוג III מלח נתרן, שהוכנו סטרילי DDH 2 O.
- ערכת miniprep מסחרי.
- סודה לימון חרוזי זכוכית (0.5 מ"מ).
- Escherichia coli המוסמכת תאים מתאים התפשטות פלסמיד (למשל DH5α, XL10 זהב) ואת התקשורת תקן מתאים התפשטות חיידקים מבחר פלסמיד.
- שמרים זנים ספציפיים פלסמידים כמפורט בפרוטוקול
- בקנה מידה גדול טרנספורמציה
- לחסן מושבה אחת של המתח מיתוס עיתונאי המכיל הפיתיון שלך לתוך 5 מ"ל של SD-leucine מדיה דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד (200 סל"ד).
- לדלל את תרבות הלילה לתוך 200 מ"ל SD-leucine התקשורת OD600 = 0.15 ו לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל"ד). לגדול עד OD600 = 0.6-0.7 (כ 4-5 שעות).
- זמן קצר לפני OD600 היעד הוא הגיע, להפשיר aliquot של פתרון ssDNA. מרתיחים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על הקרח. חזור פעם אחת.
- כאשר היעד OD600 הושג, קציר תאים באמצעות צנטריפוגה ב 700xg במשך 5 דקות (לחלק את התרבות 200 מ"ל בין 4x50 בורג מכסה צינורות מ"ל צנטריפוגות).
- לשטוף כל גלולה עם 30 מ"ל סטרילי DDH 2 O ו בקצרה מערבולת המדגם. צנטריפוגה ב 700xg במשך 5 דקות.
- בטל supernatant ו resuspend כל גלולה Acetate ב 1 מ"ל ליתיום / פתרון טריס EDTA. מעבירים צינור סטרילי mL 1.5 microfuge ו צנטריפוגות ב 700xg במשך 5 דקות.
- בטל supernatant ו resuspend כל גלולה ב 600 μL של Acetate ליתיום / פתרון טריס EDTA.
- הוסף את הפרטים הבאים 4x15 מ"ל בורג מכסה צינורות צנטריפוגה:
- 2.5 מ"ל PEG / Acetate ליתיום פתרון II
- 600 תאים resuspended μL
- 100 פתרון μL ssDNA
- 7 מיקרוגרם של ה-DNA ספריה טרף
- ספריות המכילות פושט מתויג בבית או N-הסופית או C-N עם UB G, והכינו ממגוון רחב של מקורות או cDNA גנומי, זמינים מסחרית ( www.dualsystems.com ). הספרייה ספציפי המשמש צריכה להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו, תלוי הפיתיון הנבחר לבין מטרות הניסוי.
- וורטקס צינורות דקה 1 כדי להבטיח ערבוב יסודי ואז דגירה של 30 ° C waterbath במשך 45 דקות. מערבבים בקצרה כל 15 דקות.
- הוספת 160 sulfoxide דימתיל μL (DMSO) כדי צינור כל ומערבבים מיד על ידי היפוך הצינורות.
- דגירה של 42 ° C waterbath במשך 20 דקות.
- איסוף transformants ידי צנטריפוגה ב 700xg במשך 5 דקות.
- בטל supernatant. שחזור transformants ידי resuspension של כל גלולה ב 2xYPAD מ"ל 3. בריכת כל דגימות יחד צינור אחד הברגים יתר 50 מ"ל צנטריפוגות.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות התאוששות התא.
- צנטריפוגה ב 700xg במשך 5 דקות ו למחוק את supernatant.
- Resuspend את כדורי תא 4.9 מ"ל NaCl 0.9% סטרילי.
- באמצעות 100 μL של תאים resuspended להכין פי 10 דילולים סדרתי NaCl 0.9% סטרילי החל 10x עד 1000x.
- 100 פלייט μL של דילולים 100x ו 1000x על SD-טריפטופן, לאוצין מדיה לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. לוחות אלו משמשים שליטה והם משמשים כדי לחשב את יעילות השינוי.
- לא פחות מחלקים את הנותרים 4.8 מ"ל של תאים resuspended על צלחת גדולה (150 מ"מ) SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין צלחות,המכיל את הסכום הדרוש של 3-AT כפי שנקבע UB N G / אני הבדיקה, דגירה על 30 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
- Resuspend מושבות בודדות (כל התאים המייצגים המכיל פוטנציאל אינטראקציה הפיתיון טרף זוג) בשנת 100 μL של 0.9% NaCl ו - צלחת 5 aliquots μL על SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין + X-Gal התקשורת (כולל 3-AT אם חובה). אפשר לגדול עבור 2-4 ימים. צעד זה משמש לסיבוב שני של הקרנה סלקטיבית, ומסייע לסילוק חיוביות שגויות שהתקבלו בסיבוב הראשון. מושבות אשר רק להציג צמיחה איתנה צבע כחול נבחרו לניתוח נוסף.
- ה-DNA Prey בידוד סידור
- לבודד פלסמיד דנ"א מן המושבות שמרים כחול באמצעות פרוטוקול miniprep בשינויים שתואר לעיל. הקפד גדלים התאים SD-טריפטופן מדיה בלבד, כדי לבחור עבור החזקת טרף, אך לא הפיתיון, פלסמידים. עבור מסכי המייצרים מספר גדול מאוד של להיטים, זמין מסחרית תפוקה גבוהה ערכת miniprep עשוי להיות יתרון בשלב זה.
- המרה DNA שמרים מבודדים פלסמיד לתוך E. המוסמכת coli זן מתאים התפשטות פלסמיד (למשל DH5α, XL10 זהב) עם יעילות טרנספורמציה של לפחות 1x10 7 תאים / DNA מיקרוגרם. שים לב פלסמידים טרף ניתן לבחור לשימוש אמפיצילין.
- לבודד פלסמיד דנ"א מן ה טרנספורמציה coli באמצעות תקן ה-DNA שיטת בידוד או ערכת מסחרי. שוב, ערכת תפוקה גבוהה miniprep עשוי להיות שימושי אם מספר מדגם גדול. הגברה של ה-DNA של ה coli מגדיל מאוד תשואה הפלסמיד מבטיח כי כמות מספקת של DNA הוא מתנה רצף והן ניתוח נוסף.
- רצף פלסמידים מבודדים באמצעות פריימר משלים רצף בתוך UB N G.
- Compile ולנתח את כל הנתונים רצף להרכיב רשימה ראשונית של interactors שלך. ניתן לעשות זאת באופן ידני, או באופן אוטומטי באמצעות התוכנה המתאים.
- תלות פיתיון בדיקה
- לאחר הרכבה של רשימת ראשונית של interactors חשוב לבדוק מחדש את יחסי הגומלין ולחסל פושט מופקר אשר אינטראקציה / להפעיל את מערכת הכתב באופן עצמאי הזהות הפיתיון. מטרה זו מושגת באמצעות מבחן תלות פיתיון. במבחן הזה, כל interactors מזוהה הופכים בחזרה זן את הפיתיון המקורי, כמו גם זן מחסה פיתיון מלאכותי השליטה המורכב תחום הטרנסממברני אחד התמזגו כדי לתייג את C-UB LexA-VP16. השינוי מתבצע לפי הפרוטוקול הסטנדרטי שתואר קודם לכן, באמצעות SD-leucine התקשורת במקום YPAD ו SD-טריפטופן, לאוצין התקשורת מוצק לשלב ציפוי הסופי.
- Resuspend מושבות אחת מן התמורות לעיל μL של 100 סטרילי DDH 2 O ו - 5 כרכים במקום μL על SD-טריפטופן, לאוצין, אדנין, היסטידין + X-Gal התקשורת (כולל 3-AT אם נדרש). פלטות מודגרת אז עבור 2-4 ימים ב 30 ° C. באופן אידיאלי transformants מרובים יש לבחור לטרף כל אחת, הן את הפיתיון המקורי פיתיון מלאכותי צריך להיות הבחינו לצלחת זהה.
- שמרים נושאת את הפיתיון טרף מלאכותית וכי הפעלת לגרום של מערכת הכתב (כלומר צמיחה וצבע כחול) נחשבים מופקר וכי טרף מסוים הוסר מרשימת interactors.
- פושט שגורמים לצמיחה צבע כחול שמרים עם האינטרס של הפיתיון, אבל לא את הפיתיון מלאכותית, מאשר זו אינטראקציה ספציפית. אם, לעומת זאת, שמרים מחסה טרף שלך הפיתיון של עניין לא גדלים, טרף הזה יוסר מרשימת interactors.
- פושט הנותרים מהווים את הרשימה המלאה של interactors מזוהה במסך מיתוס.
5. מחקרים נוספים
לאחר ההקרנה מיתוס הושלמה, מנתח נוסף חייב להתבצע על מנת לאמת ולקבוע את המשמעות הביולוגית של אינטראקציות זוהה. המחקרים הספציפיים שיש לבצע ישתנו על בסיס כל מקרה לגופו, ואת צריכה להיקבע על ידי החוקר הפרטי. כמה דוגמאות נפוצות של עבודה מעקב כוללים שיתוף immunoprecipitation ניסויים ומחקרים המחיקה באורגניזם הילידים. בנוסף, ניתוח חישובית של נתונים המתקבלים יכולה להיות שימושית לזיהוי דפוסים, ולעזור לזהות את הרלוונטיות התפקיד הפוטנציאלי ואינטראקציות שונות עשוי לשחק. לפיכך, הטכנולוגיה משמשת מיתוס "צעד ראשון חזק לקראת זיהוי והבנה של אינטראקציות תפקודית קריטית של חלבונים בממברנה. יחד עם מחקרי מעקב מפורטים te פיתחה לאחרונה נוספות ובשווקים המתעורריםchnologies, הוא מבטיח להיות כלי רב ערך לפיצוח תעלומות של התא.
באיור 1. עקרון הפיצול יוביקוויטין. A. היוביקוויטין ניתן להפריד לשתי moieties: חצי בטרמינל C-(C UB) ואת החצי N-מסוף (N אני UB). אלה moieties מחדש באופן ספונטני בגלל זיקה גבוהה שלהם אחד אחר. ב מוטציה אני UB נקודה במיקום 13 מתוך isoleucine כדי גליצין (N UB G) זה מונע ספונטנית מחדש העמותה. ג במערכת מיתוס, UB C הוא קיבע את האינטרס הפיתיון של (B) את הטרף הוא קיבע את UB N G (A). אינטראקציה AB חלבון reconstitutes פסאודו יוביקוויטין.
איור 2. Split-יוביקוויטין קרום השמרים מבוסס שני היברידית (מיתוס) של המערכת.
הממברנה חלבונים של ריבית (הפיתיון) הוא התמזגו למחצית בטרמינל C-של שמרים היוביקוויטין (C UB), מצומדות כדי גורם שעתוק. באמצעות ספריה cDNA או gDNA, כל חלבון המקודד על ידי הספרייה (טרף) היא התמזגו המקביל N-הסופית של מחצית היוביקוויטין (N UB G). אם שני חלבונים לא אינטראקציה, גורם שעתוק נשאר על הממשק קרום (הפאנל השמאלי). עם זאת, אם החלבונים אינטראקציה, שני moieties היוביקוויטין להצטרף, וכתוצאה מכך מחשוף על ידי פרוטאזות ספציפיות יוביקוויטין. מחשוף משחרר את גורם שעתוק, וכתוצאה מכך הביטוי של גנים הכתב (פאנל מימין)
איור 3. מיתוס צינור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיתוס היא המערכת הראשונה תפוקה גבוהה המאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין באורך מלא חלבונים בממברנה ו cytosolic או קרום הנכנס שותפים. זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד חלבון קרום מתוך מגוון רחב של אורגניזמים [3-7]. יש, עם זאת, פרטים ספציפיים כי ייתכן שיהיה צורך בחנו כדי להבטיח את החלבון של עניין הוא נוח ללמוד עם מיתוס.
רבים קרום הנכנס חלבונים מופנים קרום הפלזמה באמצעות רצף האות כי הוא ביקע מכן לייצר את החלבון הבוגר. רצף זה הוא אורגניזם ספציפי וייתכן כי זה רצף האות יליד יגרום אי - לוקליזציה של חלבונים עניין של ביטוי כאשר השמרים בגלל רצף האות נשאר בלתי מוכרים. כדי לעקוף בעיה זו, אנחנו מהונדסים אלה חלבונים ספציפיים להיות התמזגו רצף שמרים אותות, שמקורם אלפא הזדווגות גורם (MATα). זה רצף הפפטיד (מה שמכונה MFα-ss) מחדש localizes חלבון הממברנה פלזמה שמרים חשוב, הוא ביקע ידי peptidases אות שמרים. זה רצף הפפטיד נמצא פלסמידים pTMBV-MFα ו-pAMBV MFα.
פרמטר נוסף חשוב שצריך להדגיש הוא ביטוי ברמות הפיתיון. היזם שמניע ביטוי הפיתיון מסדיר בפרמטר זה. זה עשוי להיות נדרש כדי לייעל את הפיתיון רמות ביטוי באמצעות מבחן NubG / NubI וכמות 3-AT צורך לחסל חפצים overexpression, שם הפיתיון הוא "הפעלת עצמית" (כלומר הבחנה אינטראקציה עם הלא ספציפית חלבונים רבים טרף) . בחינת חלבונים שמרים מייצרת את ריכוזי הפיתיון הרלוונטי ביותר מבחינה פיזיולוגית כאשר iMYTH מוחל. במקרה זה, את הגן של ריבית מתויג עם קאב-TF בתוך gDNA. לחלופין, חלבונים ממקור חיצוני יכול לבוא לידי ביטוי מתוך pBT3-STE ו pCMBV פלסמידים הנושאים את האמרגן CYC1 וכתוצאה מכך ביטוי פיתיון נמוך. פלסמידים pTMBV ו pTLB1 הנמל האמרגן TEF1 בעוד pAMBV יש את האמרגן ADH1, הן הביטוי כונן חזק של חלבון הפיתיון. אם רמות חלבון הפיתיון דורש אופטימיזציה נוספת, ייתכן שיהיה צורך להשתמש pTLB-1 פלסמיד הנושא את האמרגן TEF1, לעומת זאת, תחום ה-DNA LexA מחייב הוא מוטציה ב R156G תפיג את הזיקה כלפי היזמים גן אקסוגניים עיתונאי, ובסופו של דבר להפחית את ההסתברות הפעלה עצמית [5].
גורם נוסף משחק תפקיד חשוב להצלחה מיתוס הוא ספריה של בחירה המשמשים בתהליך המיון. זה יהיה תלוי את הפרופילים ביטוי אנדוגני הפיתיון. לדוגמה, הפיתיון יכול להיות מבוטא ברקמות ספציפיות, ולכן חשוב להשתמש בספריית כי בנויה מרקמת הספציפי הזה. פעולה זו תבטיח פיזיולוגית אינטראקציות רלוונטי מזוהים.
מערכת מיתוס הוא כלי פשוט ומהיר המספק שפע של מידע על המעמד של חלבונים, כי כבר קשה ללמוד. אינטראקציות אלה זיהו יכול לסייע להבהרת פונקציה ביולוגית מלאה של חלבונים בממברנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
איגור Stagljar הוא מייסד שותף של DualSystems ביוטק, שוויץ.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אדמונדס שחר לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. המעבדה Stagljar נתמכת על ידי קרנות מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), קרן לב ושבץ, האגודה למלחמה בסרטן הקנדי, נוברטיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | BioShop Canada | PEG335 | |
| Lithium Acetate Bihydrate | BioShop Canada | LIA001 | |
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | BioShop Canada | XGA001 | |
| N`,N-dimethyl formamide | BioShop Canada | DMF 451 | |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | BioShop Canada | ATT124 | |
| Sodium phosphate dibasic | BioShop Canada | SPD307 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | |
| Salmon Sperm DNA | VWR international | CA80601-120 | |
| D-Glucose | BioShop Canada | GLU501 | |
| LB Broth LENOX | BioShop Canada | LBL405 | |
| Yeast Nitrogen Base | BioShop Canada | YNB406 | |
| Yeast Extract | BioShop Canada | YEX401 | |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Bio-Tryptone | BioShop Canada | TRP402 | |
| Adenine Sulphate | BioShop Canada | ADS201 | |
| L-Uracil | BioShop Canada | URA241 | |
| L-Threonine | BioShop Canada | THR002 | |
| L-Histidine | BioShop Canada | HIS200 | |
| L-Methionine | BioShop Canada | MET222 | |
| L-Valine | BioShop Canada | VAL201 | |
| L-Phenylalanine | BioShop Canada | PHA302 | |
| L-Isoleucine | BioShop Canada | ISO910 | |
| L-Tyrosine | BioShop Canada | TYR333 | |
| L-Leucine | BioShop Canada | LEU222 | |
| L-Arginine | BioShop Canada | ARG006 | |
| L-Tryptophane | Fisher Scientific | BP395-100 | |
| L-Lysine | BioShop Canada | LYS101 | |
| L-Alanine | Fisher Scientific | BP369-100 | |
| Agar | BioShop Canada | AGR001 | |
| Soda Lime Galss Beads | Biospec Products | 11079105 | |
| Sodium Chloride | BioShop Canada | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
