Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

Summary

El Solaris qPCR ensayos de expresión génica son nuevas pre-diseñados qPCR primer / sonda combinaciones diseñadas para simplificar el proceso de qPCR sin sacrificar la especificidad y la robustez de la prueba.

Abstract

El Solaris Gene qPCR ensayo de expresión es un nuevo tipo de juego de cebadores / sonda, diseñada para simplificar el proceso de qPCR mientras se mantiene la sensibilidad y la precisión de la prueba. Estos conjuntos de cebadores / sonda se pre-diseñados para> 98% de los genomas humano y del ratón y mejoras de las características importantes de las tecnologías ya disponibles. Estas mejoras han sido posibles gracias a un algoritmo de diseño novedoso, desarrollado por expertos en bioinformática Thermo Scientific.

Varias funciones convenientes han sido incorporados en el ensayo qPCR Solaris para agilizar el proceso de llevar a cabo cuantitativas PCR en tiempo real. En primer lugar, el protocolo es similar a otras alternativas comúnmente empleados, por lo que los métodos utilizados en qPCR es probable que esté familiarizado. En segundo lugar, la mezcla maestra es de color azul, lo que hace que la configuración de las reacciones qPCR más fácil de seguir. En tercer lugar, las condiciones de ciclos térmicos son los mismos para todos los ensayos (los genes), lo que permite ejecutar muchas muestras a la vez y reducir las posibilidades de error. Finalmente, la sonda y la información de la secuencia de los cebadores se proporcionan, lo que simplifica el proceso de publicación.

En este sentido, se muestra cómo obtener la reactivos de Solaris con la función de búsqueda de productos GENEius encontrar en el sitio web de pedidos (www.thermo.com / solaris) y el uso de los reactivos para la realización de Solaris qPCR utilizando el método de la curva estándar.

Protocol

1. El Thermo Scientific Solaris ensayo qPCR diseño de algoritmos

1. El algoritmo utilizado en el diseño de Solaris qPCR sonda / primer pares se ajusta a la Tm de cada componente lo que permite condiciones universales ciclismo. Obligatoria la incorporación de la MGB, o surco menor, fracción en la investigación aumenta el Tm y permite una más corta que las sondas diseñadas para la flexibilidad y el rendimiento del ensayo mayor. Como su nombre indica, MGBs son una clase de antibióticos que pueden encajar en el surco menor de la hélice del ADN. MGBs se adjunta al final de 3 a 5 de una sonda de ADN. En la solución, la fluorescencia reportero FAM de la sonda se apaga por saciar la Eclipse oscuro. Cuando la sonda se une a una secuencia objetivo, el cambio resultante en 3-D la conformación de la sonda s permite que una señal fluorescente fuerte. La unión de la sonda de ADN de secuencia objetivo es estabilizado por el MGB, que permite el uso de muy específicas, las sondas más cortas, manteniendo la temperatura de fusión adecuado para PCR. Por lo tanto, la detección de la señal se produce durante la fase de recocido de amplificación de la diana. Durante la etapa de extensión, la sonda MGB se disocia y la fluorescencia se apaga de nuevo. Debido a que la sonda se disocia, no afecta la eficiencia de la PCR.
2. Otra característica del algoritmo de Solaris es el uso de superbases. Superbases se modifican las bases que han mejorado la capacidad de unión para mejorar la estabilidad de los bonos A y eliminar GG libre asociación en guanina secuencias ricas. Por otra parte, no apagar fluoróforos adyacentes conectados a la terminal 5. Estas bases son colocados de forma selectiva, de acuerdo con el algoritmo, para ampliar la disponibilidad de la secuencia blanco. Esto hace posible el uso de secuencias, como las regiones ricas en GC, que de otra forma se evitaría en el diseño de cebadores y sondas.
3. Siempre que sea posible, el algoritmo de Solaris incluye las regiones de unión exón de expansión en el sitio de destino. Esto aumenta la especificidad al evitar la amplificación de ADN genómico contaminante.
4. Es importante destacar que el algoritmo también identifica una secuencia consenso de todas las variantes de empalme conocidos, de tal manera que todos están cubiertos por una sola sonda / primer set. Por lo tanto, sólo un ensayo que se necesita para un determinado gen de interés.
5. Por último, el sistema operativo Solaris ensayo qPCR algoritmo de diseño utiliza parámetros muy estrictos para las consideraciones de diseño críticos, entre ellos el contenido de GC, la duración, Tm, y tramos de nucleótidos homogénea. Las secuencias resultantes se analizaron para BLAST especificidad con tres diferentes bases de datos: genómica, el expediente académico, y pseudogen.

2. La obtención de reactivos Solaris

1. Para obtener los reactivos de Solaris, visite www.thermo.com / solaris
2. Una vez en el sitio web, haga clic en "Búsqueda de Productos GENEius". Para ir directamente a la búsqueda de productos GENEius, vaya a www.thermo.com / SolarisSearch
3. Haga clic en la caja de consulta de búsqueda y elegir el organismo de destino apropiado.
4. La búsqueda de productos GENEius puede procesar muchos identificadores de genes diferentes. Aquí se pueden introducir uno de los términos de búsqueda sugeridos para encontrar el gen de interés, incluyendo Ref. Sec. de adhesión, la identificación de genes, el símbolo del gen, una descripción de genes, la identificación o el número de Sanger, o un número de catálogo. A continuación, haga clic en "Buscar".
5. Identificar el gen de interés y haga clic en "Seleccionar" en el lado izquierdo. Esto abrirá una ventana que muestra los diferentes productos de Thermo Scientific para el gen de interés. En "Productos" seleccione la opción "Detección de qPCR" Tab.
6. En el marco del "Ensayo de Solaris expresión génica" la partida, podrás ver un óptimo diseño de la sonda Solaris / ensayo manual. Este ensayo un cubrirá todas las variantes conocidas de empalme de genes objetivo. Elija la cantidad deseada. Están disponibles en 100, 200, 400 y
   1000 X 25 reacciones l (si el ensayo se identifica como hecho a la medida, el tamaño del paquete de 100 no estará disponible). Haga clic en "Añadir al carro".
7. A continuación, seleccionar la combinación adecuada para dominar el termociclador que se utilizará. Para determinar qué mezcla maestra que funcionará mejor con la máquina disponible, haga clic en "Find a Mix Master, que funciona mejor con su termociclador de PCR!"
8. Buscar la cicladora qPCR que se utilizará en el menú para determinar cuál es la combinación de su uso.
9. Volver a la ventana de búsqueda GENEius producto, y seleccionar la combinación maestro adecuado. La mezcla maestra viene en 100, 200, 400 y 1000 tamaños de reacción. Haga clic en "Añadir al carro".
10. Genes de referencia sugerido y los kits de verso cDNA síntesis también se puede pedir para una completa QRT-PCR análisis.
11. Cuando los reactivos Solaris qPCR llegar, almacenarlos a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. Los siguientes reactivos deben ser recibidos: Una solución de 20X, con dos primers siempre a 800 nM cada uno y una sonda del gen específico establecido en 200 nm, secuenciadorescia de información tanto para la sonda y cebadores, y Solaris Gene qPCR Expresión Master Mix en una concentración de 2X. Solaris qPCR ensayos de expresión de genes son estables durante un mínimo de 12 meses. Evite congelar y descongelar repetidas.

3. qPCR configuración

1. Comience el protocolo qPCR con cDNA. ARN total se extrajo utilizando un método spin columna. El Thermo Scientific kit Verso cDNA síntesis se recomienda para la transcripción inversa para generar ADNc.
2. Prepárese para qPCR por el deshielo de los cebadores, las sondas, y mezcla maestra sobre el hielo. También tener a mano agua grado PCR y qPCR opaco placas blancas, que pueden mejorar la sensibilidad de la PCR en tiempo real.
3. La mezcla maestra contiene todos los componentes para PCR en tiempo real, incluyendo: 1) la ADN polimerasa Thermo-Start, una versión de arranque en caliente de la ADN polimerasa Thermoprime. Este tipo de polimerasa se utiliza para evitar la amplificación no específica durante la reacción de instalar y requiere la activación de paso a 95 ° C 15 min. 2) en la mezcla de dNTPs Solaris Maestro, dTTP reemplaza dUTP para maximizar la eficiencia de amplificación 3) tampón de reacción de propiedad, optimizado para trabajar con Solaris cartilla / sonda de ensayos. Este tampón de reacción contiene un tinte azul para aumentar el contraste entre el reactivo y el plástico. 4) ROX, si su instrumento qPCR requiere ROX.
4. Una vez que las soluciones se han descongelado, mezcle agitando el tubo (no vortex). Girar hacia abajo para evitar la pérdida de reactivo.
5. Luego, prepare un tubo de 15 ml estériles Falcon para establecer la mezcla de reacción para el gen de interés, más uno para el gen de referencia, la ampliación en función del número de muestras. Prepare suficiente como para que tres réplicas se pueden preparar para cada muestra, incluyendo un control sin plantilla (NTC) y las muestras de la curva estándar, si el método de la curva estándar se utiliza para el análisis.
6. Para cada muestra se ejecutan en una placa y 96, mezclar los siguientes: 5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 0,5 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua PCR grado tal que el volumen final de reacción, una vez el ADNc se agrega será de 25 mL. Para cada muestra se ejecutan en una placa de 384 y mezclar los siguientes: 12,5 l de la mezcla de Solaris qPCR 2X Master, 1,25 l de la versión de Solaris Primer / sonda conjunto (20 veces), y el agua como PCR grado que el volumen final de reacción, una vez que el cDNA se agrega será de 10 mL.
7. Utilizando una pipeta multicanal, la transferencia de la mezcla maestra a los pocillos correspondientes de la placa. El tinte azul incluido en la mezcla maestra ayudará en el progreso de pipeteo de seguimiento en las placas blancas. A continuación, agregue el 5.1 l plantilla de cDNA (de una placa y 96) o 2.1 L de cDNA plantilla (para una placa de 384 pocillos). Pipeta de arriba a abajo para mezclar. Colocar la placa en una centrífuga y centrifugar para eliminar las burbujas, ya que estos interfieren con las lecturas de fluorescencia.
8. Programa del termociclador: La enzima se debe activar con un 95 º C 15 minutos (1 ciclo). Luego 40 ciclos de 95 ° C, la desnaturalización de 15 segundos, y el recocido y extensión a 60 ° C durante 60 segundos.
9. Colocar la placa en el instrumento qPCR. Iniciar el programa.

Representante qPCR resultados utilizando Solaris

Figura 1. Ensayos de Solaris dar una detección fiable incluso en concentraciones muy bajas de entrada, a juzgar por la eficiencia de la PCR y los valores de r2. Diez de 10 diluciones de cDNA sintetizado a partir de la secuencia sintética de amplificación del ARN o la secuencia de amplificación de ADN se amplificó en un instrumento ABI 7900HT con Solaris Gene qPCR ensayo de expresión de F2RL1 o Cdc20, respectivamente. Las curvas de amplificación escala logarítmica, y las curvas de calibración se muestran junto con el rendimiento de cada ensayo en particular la eficiencia, el valor de r2, el rango dinámico de 10 log10 diluciones y el límite inferior de detección.

Figura 2. Ensayos de Solaris dar resultados consistentes, incluso entre los diferentes investigadores y laboratorios. siRNAs dirigidos ALDOA y PPIB, así como un control no-objetivo (NTC), fueron transfectadas en células HeLa a 100 nm, 10, 1 y 0,1 la concentración final. Las células fueron cosechadas y el ARN total aislado 48 horas después del tratamiento. cDNA fue sintetizado utilizando Thermo Scientific Kit Verso cDNA Síntesis. Una alícuota del cDNA se amplificó en dos laboratorios separados geográficamente, utilizando Solaris qPCR ensayos de expresión genética para la detección de ALDOA, PPIB y GAPDH en un LightCycler de Roche 480 (de 384 pozos) de la plataforma. Caída se calculó utilizando el método ΔΔCq (normalizado a GAPDH genes de referencia y las células tratadas con NTC). Los mismos niveles de caída se manifestó en favor tanto de los objetivos de genes entre los dos investigadores en ambos sitios.

Discussion

Thermo Scientific Solaris ensayos qPCR un método sencillo, mejor para la realización de análisis qPCR. Utilizando un algoritmo de alto rigor, la incorporación de la tecnología y la MGB superbases, estos conjuntos de cebadores y sonda de maximizar la fidelidad y la solidez de los experimentos de qPCR. Un primer y sonda conjunto reconoce todas las variantes conocidas de empalme de un determinado gen. El sitio de destino, siempre que sea posible, incluye las regiones que abarca el exón, para asegurarse de que el ADN genómico no se amplifica. Estas características hacen posible el funcionamiento de numerosas muestras de forma simultánea, lo que reduce la cantidad de tiempo necesario para realizar experimentos complejos. Dado que la mezcla principal es azul, es posible el uso de placas de color blanco opaco, lo que mejora la sensibilidad de la PCR cuantitativa, sin perder de vista la pipeta.

En conjunto, las características de diseño del ensayo qPCR Solaris hacen de este ensayo qPCR novela un ensayo simple, pero de alto rendimiento que es específica y sólida.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics