Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

Summary

Solaris qPCR Gene Expression Analyser roman föranpassade qPCR grundfärg / sond kombinationer för att förenkla qPCR processen utan att offra specificitet och robustheten i analysen.

Abstract

Solaris qPCR Gene Expression-analysen är en ny typ av grundfärg / sond som är avsedda att förenkla qPCR processen med bibehållen känslighet och noggrannhet analysen. Dessa grundfärg / probe-apparater är redan utformade för att> 98% av det mänskliga och mus genom och har betydande förbättringar från tidigare tillgängliga teknik. Dessa förbättringar har gjorts möjligt genom en ny konstruktion algoritm, utvecklad av Thermo Scientific bioinformatik experter.

Flera praktiska funktioner har införts i Solaris qPCR-analys för att effektivisera processen för att utföra kvantitativa realtids-PCR. För det första är det protokoll som liknar vanligen används alternativ, så de metoder som används under qPCR sannolikt kommer att känna. För det andra är Master Mix blå, vilket gör inställning av qPCR reaktioner lättare att spåra. För det tredje, termisk cykling är samma för alla analyser (gener), vilket gör det möjligt att köra många prover på en gång och minska risken för fel. Slutligen sonden och primer sekvens information, vilket förenklar publiceringsprocessen.

Här visar vi hur du kan få relevanta Solaris-reagenser med GENEius funktionen produktsökning finns på beställning webbplats (www.thermo.com / solaris) och hur du använder Solaris reagenser för att utföra qPCR hjälp av standardkurvan metoden.

Protocol

1. Thermo Scientific Solaris qPCR analys Design algoritm

1. Den algoritm som används i konstruktionen av Solaris qPCR sond / primerpar justerar Tm av varje komponent vilket möjliggör universell cykling förhållanden. Införlivandet av MGB, eller minor groove bindande delen hos sonden ökar TM och möjliggör kortare sonder vara utformade för större analys flexibilitet och prestanda. Som namnet antyder, MGBs är en klass av antibiotika som kan passa in i de mindre spår av DNA-spiralen. MGBs är anslutna till 3 eller 5 i slutet av en DNA-probe. I lösning är FAM reporter fluorescens av sonden släcks av Eclipse Mörk Quencher. När sonden binder till en målsekvens, kan den resulterande förändringen i sonden s 3-D konformation ett starkt fluorescerande signal. Bindning av DNA-sonden att målsekvens stabiliseras av MGB, vilket tillåter användning av mycket specifika, kortare sonder samtidigt bibehålla en lämplig smälttemperaturen för PCR. Således uppstår signal upptäckt under glödgning fas mål förstärkning. Under förlängningen steg, tar avstånd MGB sond och fluorescens är åter släckt. Eftersom sonden tar avstånd, påverkar det inte PCR-effektiviteten.
2. En annan funktion i Solaris-algoritmen är användningen av Superbases. Superbases är modifierade baser som stärkt bindande förmåga att förbättra stabiliteten AT obligationer och eliminera GG själv-förening i guanin rika sekvenser. Dessutom behöver släcka de inte intilliggande fluoroforer fäst vid 5 ändstationen. Dessa baser är selektivt placerade enligt algoritm, för att öka tillgången på mål sekvenser. Detta gör det möjligt att använda sekvenser, såsom GC rika regioner, som annars skulle kunna undvikas i utformningen primers och prober.
3. När det är möjligt, innehåller Solaris algoritmen exon korsningen spänner över områden i målet platsen. Detta ökar specificitet genom att undvika förstärkningen av föroreningar arvsmassans DNA.
4. Viktigt identifierar algoritmen också en enighet sekvens för alla kända skarva varianter, så att alla omfattas av en ensam sond / primer set. Så, bara en analys som behövs för en viss gen av intresse.
5. Slutligen använder Solaris qPCR analys konstruktion algoritm mycket stränga parametrar för kritisk design överväganden inklusive GC innehåll, längd, TM och sträckor homogen nukleotider. Den resulterande sekvenser BLAST analyseras för specificitet med hjälp av tre olika databaser: genomisk, avskrift och pseudogene.

2. Skaffa Solaris Reagenser

1. För att få relevanta Solaris reagenser, besök www.thermo.com / solaris
2. Väl på hemsidan klicka på "GENEius Product Search". För att gå direkt till GENEius produktsökning, gå till www.thermo.com / SolarisSearch
3. Klicka i sökandet förfrågan rutan och välj lämplig målorganismen.
4. Den GENEius produktsökning kan bearbeta många olika gener identifierare. Här anger du ett av de föreslagna sökord för att hitta genen av intresse, däribland Ref Seq anslutningsakt är Gene-ID, Gene Symbol, en gen Beskrivning, Sanger-ID eller anslutning nummer, eller ett katalognummer. Klicka sedan på "Sök".
5. Identifiera genen av intresse och klicka på "Välj" på vänster sida. Då öppnas ett fönster som visar de olika Thermo Scientific produkter tillgängliga för genen av intresse. Under "Produkter" välja "qPCR Detection"-fliken.
6. Under "Solaris Gene Expression Assay" rubrik kommer du att se en optimalt utformad Solaris sond / primer analys. Den här analysen kommer att täcka alla kända skarva varianter av genen mål. Välj önskad mängd. De finns i 100, 200, 400 och
   1000 X 25 l reaktioner (om analysen identifieras som görs på beställning, kommer 100 förpackningsstorlek inte tillgänglig). Klicka på "Lägg i varukorgen".
7. Välj sedan lämplig Master Mix för värmecykeln som kommer att användas. För att avgöra vilken Master Mix fungerar bäst med maskinen som finns, klicka på "Ta reda på vilka Master Mix fungerar bäst med din PCR Cycler!"
8. Hitta qPCR apparat som kommer att användas på menyn för att avgöra vilken mix att använda.
9. Återvänd till GENEius produktsökning fönstret och välj lämpligt Master Mix. Master Mix kommer i 100, 200, 400 och 1000 storlekar reaktion. Klicka på "Lägg i varukorgen".
10. Föreslagna hänvisningen gener och baksidan cDNA kit syntes kan också beställas för en komplett QRT-PCR-analys.
11. När Solaris qPCR reagenser anländer, förvara dem vid -20 ° C tills produkten ska användas. Följande reagenser bör tas emot: en 20x lösning som innehåller två grundfärger som tillhandahålls på 800 nm var och en gen specifik sonden ges på 200 nm, sequENCE information för både givaren och grundfärger, och Solaris qPCR Gene Expression Master Mix i en 2X koncentration. Solaris qPCR Gene Expression Analyser är stabila i minst 12 månader. Undvik upprepad frysning upptining.

3. qPCR installation

1. Börja qPCR protokoll med cDNA. Total RNA ska hämtas genom att använda en metod spin kolumn. Thermo Scientific Verso cDNA syntes kit rekommenderas för omvänd transkription för att skapa cDNA.
2. Förbered för qPCR av upptining primers, prober och Master Mix på is. Dessutom har på handen PCR-kvalitet vatten och ogenomskinliga vita tallrikar qPCR, som kan förbättra känsligheten för realtids-PCR.
3. Master Mix innehåller alla komponenter för realtids PCR bland annat: 1) Thermo-Start DNA-polymeras, ett hot-start version av Thermoprime DNA-polymeras. Denna typ av polymeras används för att förhindra icke-specifika PCR under reaktion ställa in och kräver aktivering steg vid 95 ° C 15 min. 2) dNTPs i Solaris Master Mix, ersätter dTTP dUTP att maximera förstärkningen effektiviteten 3) Patentskyddad reaktion buffert, optimerad för att fungera med Solaris grundfärg / probe analyser. Denna reaktion buffert innehåller blå färg för att öka kontrasten mellan reagens och plast. 4) ROX, om din qPCR instrumentet kräver ROX.
4. När lösningar har tinat, blanda genom att ställa röret (inte vortex). Spin ner dem för att förhindra förlust av reagens.
5. Därefter förbereda en 15 ml sterilt Falcon rör för att ställa in reaktionsblandningen för gen, plus en för referens genen, skala upp beroende på antalet prov. Förbered nog så att tre replikat kan förberedas för varje prov, inklusive en ingen mall kontroll (NTC) och standard prover kurva, om standardkurvan metod kommer att användas för analys.
6. För varje prov köras på en 96 brunnar, blanda med följande: 5 mikroliter av 2X Solaris qPCR Master Mix, 0,5 l av Solaris Primer / Probe set (20X), och PCR-kvalitet vatten att den slutliga reaktionen volym, en gång det cDNA som läggs kommer att vara 25 mikroliter. För varje prov körs på en 384 brunnar mix följande: 12,5 mikroliter av 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 l av Solaris Primer / Probe set (20X), och PCR-kvalitet vatten att den slutliga reaktionen volym, när cDNA läggs till blir 10 mikroliter.
7. Med hjälp av en flerkanalig pipett, överföra Master Mix till respektive brunnar i plattan. Den blå färgen som ingår i Master Mix kommer att hjälpa att spåra pipettera framsteg på de vita plattorna. Lägg sedan till 1-5 mikroliter cDNA mall (för en 96 brunnar) eller 1-2 mikroliter av cDNA mall (för en 384 brunnar). Pipettera upp och ner för att blanda. Placera plattan i en centrifug och spinn ner för att ta bort alla bubblor, eftersom dessa kommer att störa fluorescens avläsningar.
8. Programmera värmecykeln: Enzymet måste aktiveras med en 95 ° C 15 min (1 cykel). Sedan 40 cykler av 95 ° C, denaturering i 15 sekunder och glödgning och utbyggnad vid 60 ° C i 60 sekunder.
9. Placera plattan i qPCR instrumentet. Starta programmet.

Representant qPCR resultat med hjälp av Solaris

Figur 1. Solaris-analyser ger tillförlitlig detektering även vid mycket låga input koncentrationer som bedöms av PCR effektivitet och värden r2. Tio 10-faldigt utspädningar av cDNA syntetiseras från syntetiska RNA amplicon sekvens eller DNA-amplicon sekvens förstärktes på ett ABI 7900HT instrument använder Solaris qPCR analys Gene Expression för F2RL1 eller CDC20, respektive. Den log-skala förstärkning kurvor och standardkurvor visas tillsammans med resultatet för varje analys däribland effektivitet, r2 värde, dynamiskt omfång av 10 log10 utspädningar och den nedre gränsen för upptäckt.

Figur 2. Solaris-analyser ger konsekventa resultat även mellan olika forskare och laboratorier. siRNA riktade ALDOA och PPIB, liksom en icke-inriktning Control (NTC), var transfekterade i HeLa celler på 100, 10, 1 och 0,1 nM slutkoncentrationer. Celler har skördats och totala RNA isoleras 48 timmar efter behandling. cDNA syntetiserades med Thermo Scientific Verso cDNA syntes Kit. Ett delprov av det cDNA som förstärktes i två geografiskt åtskilda laboratorier som använder Solaris qPCR analyser Gene Expression för detektion av ALDOA, PPIB och GAPDH på en Roche LightCycler 480 (384 brunnar) plattform. ÖVERVÄLDIGANDE beräknades med hjälp av ΔΔCq metoden (normaliserad till GAPDH referens gen och NTC-behandlade celler). Samma nivåer av ÖVERVÄLDIGANDE visades för både gen mål mellan de båda forskarna vid båda webbplatserna.

Discussion

Thermo Scientific Solaris qPCR Analyser ge en enkel, förbättrad metod för att utföra qPCR analys. Med hjälp av en hög stringens algoritm, försedda MGB teknik och Superbases, dessa primer och sond sätter maximera trohet och stabilitet qPCR experiment. En primer och sond som erkänner alla kända skarv varianter av en viss gen. Målet plats, om möjligt, innehåller exon spänner regioner, för att säkerställa att arvsmassans DNA inte är förstärkt. Dessa funktioner gör det möjligt att köra flera prover samtidigt, vilket kraftigt minskar den tid som behövs för att utföra komplexa experiment. Eftersom Master Mix är blå, är det möjligt att använda vit ogenomskinlig plattor, som förbättrar känsligheten hos qPCR, utan att förlora koll på pipettering.

Vidtagit alla tillsammans, design funktioner i Solaris qPCR analys gör denna roman qPCR analys en enkel, men ändå högpresterande analys som är både specifika och robust.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics