实时定量PCR使用的Thermo Scientific的Solaris定量PCR检测

Summary

的Solaris qPCR的基因表达分析小说预先设计的定量PCR引物/探针组合，旨在简化不牺牲检测的特异性和稳健性的qPCR过程。

Abstract

在Solaris qPCR的基因表达检测是一种新型的引物/探针设置，设计简化的qPCR的过程，同时保持检测的灵敏度和准确性。这些引物/探针集是预先设计> 98％的人类和小鼠基因组和功能显着改善，从以前提供的技术。这些改进可能凭借Thermo Scientific的生物信息学专家的发展，一种新的设计方法。

几个方便的特点已被纳入到Solaris定量PCR检测，以简化过程进行实时定量PCR。首先，该协议是类似的普遍采用的替代品，所以在定量PCR所使用的方法很可能要熟悉。二，主结构是蓝色的，这使得设置的qPCR反应更容易追踪。三，热循环条件是所有检测（基因），从而有可能同时运行的许多样品和减少潜在的错误。最后，探针和引物序列信息提供，简化出版过程。

在这里，我们将演示如何使用产品搜索功能上的订购网站（www.thermo.com / Solaris）的发现和如何使用的Solaris试剂使用标准曲线法执行的qPCR GENEius获得适当的Solaris试剂。

Protocol

1。的Thermo Scientific的Solaris定量PCR检测设计算法

1. 在设计的Solaris qPCR的探针/引物对所使用的算法调整每个组件从而使通用循环条件的Tm。团的MGB探针，或轻微的凹槽约束力，在探头的基团增加以旧换新，并允许更短的设计更大的灵活性和性能检测的探头。顾名思义，MGBs是一类抗生素，可以容纳到DNA双螺旋的小沟。 MGBs连接到一个DNA探针的3或5月底。 FAM记者荧光探针在溶液中，是由Eclipse暗淬灭淬火。当探针结合到靶序列，在探头第3条的三维构象的变化，允许一个强烈的荧光信号。靶序列的DNA探针结合的稳定的MGB探针，它允许使用高度特异性的，更短的探针，而保持适当的熔融温度为PCR。因此，信号检测过程中发生的目标扩增的退火阶段。在延伸，MGB探针不赞成和荧光又是不灭的。因为探头不赞成，不影响PCR的效率。
2. 在Solaris算法的另一个特点是使用Superbases。 Superbases被修改，增强结合能力，以改善对AT债券的稳定和消除GG鸟嘌呤丰富的序列自我协会的基地。此外，他们不解渴5总站连接相邻的荧光团。这些基地选择性地，根据算法，扩大目标序列的可用性。这使得它可以使用，否则将避免在设计引物和探针的序列，如GC丰富的地区，。
3. 只要有可能，在Solaris算法采用外显子交界处，在目标网站跨越地区。这增加了避免污染物的基因组DNA扩增的特异性。
4. 重要的是，该算法还确定了所有已知的剪接变异体的共识序列，等，都是由一个单一的探针/引物覆盖。所以，只有一个实验是需要一个感兴趣的特定基因。
5. 最后，在Solaris的qPCR实验设计算法采用了非常严格的关键设计考虑的参数包括GC含量，长度，TM，和同质核苷酸的延伸。结果序列分析使用3种不同的数据库的特殊性的冲击：基因组，转录和假。

2。获取的Solaris试剂

1. 要获得适当的Solaris试剂，请访问www.thermo.com / Solaris的
2. 一旦在网站上点击“GENEius产品搜索”。要直接去GENEius产品搜索，请访问www.thermo.com / SolarisSearch
3. 点击在搜索查询框，并选择适当的目标有机体。
4. GENEius产品搜索，可以处理许多不同的基因标识。在这里，输入建议的搜索条件，寻找感兴趣的基因，其中包括加入参考序列，基因编号，基因符号，基因描述，桑格ID或加入号码，或目录号之一。然后，点击“搜索”。
5. 确定感兴趣的基因，并点击“选择”在左侧。这将打开一个窗口，显示不同的Thermo感兴趣的基因科技产品。根据“产品”，选择“定量PCR检测”选项卡。
6. 的“Solaris基因表达检测”的标题下，你会看到一个优化设计的Solaris探针/引物检测。此法将涵盖所有已知的基因目标的剪接变异体。选择所需的数量。他们在100，200，400，
   1000 × 25μL的反应（100包大小，如果检测到，将无法使用）。点击“添加到购物车”。
7. 下一步，选择适当的热循环仪将用于主组合。要确定哪位高手组合将与现有的机器最好，单击“查找出最好与你的PCR扩增仪主混音作品！”
8. 寻找定量PCR基因扩增仪，将在菜单上使用，以确定哪些组合使用。
9. 返回GENEius产品搜索窗口，并选择适当的主结构。主结构，100，200，400和1000的反应大小。点击“添加到购物车”。
10. 建议参考的基因和Verso cDNA合成试剂盒也可以订购一个完整的QRT - PCR分析。
11. 当Solaris定量PCR试剂后，储存在-20 ° C，直到他们准备使用。应收到以下试剂：一个20X的解决方案，其中包含两个引物在800 nm的每一个基因特异性探针在200纳米，色曲提供提供探针和引物，和Solaris的qPCR基因表达的2倍浓度的预混ENCE信息。至少12个月的Solaris qPCR的基因表达分析稳定。避免重复冷冻解冻。

3。 qPCR的设置

1. 开始与基因的qPCR协议。应使用离心柱方法提取总RNA。建议的Thermo Scientific Verso公司cDNA合成试剂盒进行反转录生成的cDNA。
2. 解冻的引物，探针，并掌握冰混合准备的qPCR。另外手头上有PCR级水和白色不透明的qPCR板，它可以提高实时PCR的敏感性。
3. 主结构包含在内的所有实时PCR的组成部分：1）热启动DNA聚合酶，Thermoprime DNA聚合酶的热启动版本。这种类型的聚合酶是用来防止非特异性扩增反应的成立过程中和需要激活步骤在95 ° C 15分钟。 2）在Solaris预混dNTPs，dTTP的替代的dUTP最大限度地扩增效率3）专有反应​​缓冲液，优化工作与Solaris引物/探针检测。这个反应缓冲液含有蓝色染料增加试剂和塑料之间的对比。 4）ROX，如果您的qPCR仪器需要ROX。
4. 一旦解决方案已经解冻，混合弹管（不涡）。分拆下来，以防止试剂损失。
5. 下一步，准备一个15毫升无菌猎鹰管成立的感兴趣的基因，加上一个参照基因扩大取决于样本数，反应组合。这样三个复制可以为每个样品准备，包括无模板对照（NTC）和标准曲线的样品，如果将供分析用的标准曲线法，准备足够的。
6. 对于每个样品的96孔板上运行，混合以下内容：5μL2X的Solaris qPCR的预混，0.5μL的Solaris一套引物/探针（20X），PCR级水等，最终反应体积，一旦的cDNA，将25μL。对于每个样品384孔板上运行组合如下：12.5μL2X的Solaris qPCR的预混的Solaris一套引物/探针（20X），1.25μL，PCR级水等，最终反应体积，一旦基因添加10μL。
7. 使用多通道移液器，传输中，主机结构的钢板适当的水井。主结构中的蓝色染料，将有助于跟踪上的白色板吹打进展。然后，添加1-5μLcDNA模板（96孔板）或1-2μLcDNA模板（384孔板）。移液器上下搭配。板放置在离心机和自旋向下，以消除任何气泡，因为这些都会干扰与荧光读数。
8. 计划的热循环仪：必须激活这种酶与95 ° C，15分钟（1个周期）。 40周期95℃，15秒的变性，退火和延伸，在60 ° C为60秒。
9. 将在qPCR的仪器板。启动程序。

使用Solaris的代表qPCR的结果

图1。PCR的效率和R2的值来判断的Solaris检测提供可靠的检测，即使在非常低的输入浓度。在ABI 7900HT使用的Solaris qPCR的基因表达检测仪器分别为F2RL1或CDC20，10个10倍稀释的合成，合成的RNA扩增序列或DNA扩增序列的cDNA扩增。日志规模的扩增曲线和标准曲线显示随着每次检测的性能，包括效率，R2的值，动态范围10 LOG10稀释，检测下限。

图2的Solaris分析给出一致的结果，甚至不同的研究人员和实验室之间。 100，10，1和0.1 nm的最终浓度的siRNA靶向ALDOA和PPIB，以及非针对控制（NTC），分别转染HeLa细胞。收获细胞总RNA隔离治疗后48小时。合成cDNA，使用Thermo Scientific的Verso公司cDNA合成试剂盒。在地理上分开的两个实验室使用罗氏的LightCycler 480（384孔）平台的Solaris qPCR的基因表达分析检测ALDOA，PPIB和GAPDH扩增的cDNA液。计算使用ΔΔCq法（归参照基因GAPDH的和负温度系数（NTC）处理的细胞）击倒。击倒相同的水平进行了论证研究人员在两个站点之间的靶基因。

Discussion

Thermo Scientific的的Solaris qPCR实验提供了一个简单的，执行的qPCR分析方法的改进。这些套引物和探针使用高紧缩算法，结合MGB探针技术和Superbases，最大化的qPCR实验的保真度和鲁棒性。一个引物和探针组认识到所有已知的一个特定基因的剪接变异体。目标站点，只要有可能，包括跨越外显子区域，以确保未扩增，基因组DNA。这些特性使得可以同时运行众多的样品，大大减少了执行复杂的实验，所需的时间量。由于主结构是蓝色的，它有可能使用白色不透明板，这对提高定量PCR的灵敏度，而不会失去跟踪的吹打，的。

的Solaris定量PCR检测的设计特点，采取一切在一起，使这本小说的qPCR检测一个简单的，但具体和可靠的高性能的检测。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics