Biology

써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

Published: June 17, 2010 doi: 10.3791/1700

Christy Ogrean¹, Ben Jackson¹, James Covino¹

¹Thermo Scientific Solaris qPCR Products

Summary

솔라리스 qPCR 진 표현 Assays은 분석의 특이성과 견고을 희생하지 않고 qPCR 프로세스를 단순화하기위한 새로운 사전 설계 qPCR 뇌관 / 프로브 조합입니다.

Abstract

솔라리스 qPCR의 유전자 발현 분석은 분석의 감도와 정확성을 유지하면서 qPCR 프로세스를 단순화하도록 설계된 프라이머 / 프로브 집합의 소설 형식입니다. 이러한 프라이머 / 프로브 세트는 이전에 다음 ID로 사용 가능한 기술에서 인간과 마우스 genomes과 기능 크게 향상> 98% 사전 설계되었습니다. 이러한 개선은 써모 과학 생물 정보학 전문가에 의해 개발된 새로운 설계 알고리즘의 미덕으로 가능하게되었다.

몇 가지 편리한 기능이 양적 실시간 PCR을 수행하는 과정을 간소화하기 위해 솔라리스 qPCR 분석에 통합되었습니다. 첫째, 프로토콜은 일반적으로 고용 대안과 유사하므로 qPCR하는 동안 사용되는 방법은 알고 있어야 할 것 같다. 둘째, 마스터 믹스 트랙에 qPCR 반응을 쉽게 설정하게하는 파란색입니다. 셋째, 열 사이클링 조건은 가능한 한 번에 많은 샘플을 실행 만들고 오류의 가능성을 감소 (유전자) 모든 assays에 대해 동일합니다. 마지막으로, 프로브 및 프라이머 서열 정보는 출판 프로세스를 단순화 제공됩니다.

여기, 우리는 주문 웹 사이트 (www.thermo.com / 솔라리스)와 어떻게 표준 곡선 방법을 사용하여 qPCR을 수행하기위한 솔라리스 시약을 사용하여 발견 GENEius 제품 검색 기능을 사용하여 적절한 솔라리스 시약을 얻는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 써모 과학 솔라리스 qPCR 분석 설계 알고리즘

솔라리스 qPCR 프로브 / 프라이머 쌍 설계에 사용되는 알고리즘은이를 보편적인 사이클링 조건을 사용 각 구성 요소의 TM을 조정합니다. MGB의 결합, 또는 사소한 홈 바인딩, 탐사선의 잔기가 TM을 증가하고 큰 분석 유연성과 성능을 위해 설계되고 짧은 프로브를 허용합니다. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, MGBs는 DNA의 나선형의 작은 홈에 끼워 넣을 수 항생제의 수업입니다. MGBs는 DNA 프로브의 3 또는 5 끝에 붙어 있습니다. 솔루션에서 프로브의 식구들 기자의 형광은 이클립스 다크 끄는로 침묵이다. 탐사선이 대상 시퀀스에 바인딩하면 프로브의 3 - D 형태의 결과 변화는 강한 형광 신호를 수 있습니다. 대상 순서로 DNA 프로브의 바인딩은 PCR에 적합한 용융 온도를 유지하는 동시에 매우 구체적이고 짧은 프로브의 사용을 허용하는 MGB에 의해 안정화됩니다. 따라서, 신호 감지 대상 증폭의 어닐링 단계에서 발생합니다. 확장 단계 동안, MGB 프로브 disassociates 및 형광 다시 침묵합니다. 탐사선이 disassociates 때문에 PCR의 효율에 영향을주지 않습니다.
솔라리스 알고리즘의 또 다른 특징은 Superbases를 사용하는 것입니다. Superbases는 채권 AT의 안정성을 개선하고 GG 구아닌 풍부한 시퀀스에서 자체 연결을 제거하는 바인딩 능력을 강화해야 기지를 수정하고 있습니다. 또한, 그들은 5 종착역에 연결된 인접 fluorophores를 끄지 마십시오. 이러한 기반은 선택 대상 시퀀스의 가용성을 확장하는 알고리즘에 따라 배치됩니다. 이렇게하면 별도 primers와 프로브를 설계 피해야 될 같은 GC 풍부한 지역으로 시퀀스를 사용 수 있습니다.
가능하면 솔라리스 알고리즘은 대상 사이트의 엑손 접합부까지의 영역을 포함합니다. 이것은 오염 물질의 게놈 DNA의 증폭을 피하고하여 특이성을 증가시킵니다.
중요한 알고리즘은 또한이 단일 프로브 / 프라이머 세트에 포함되는 등 알려진 모든 변종 스플 라이스에 대한 합의 순서를 식별합니다. 그래서, 하나의 분석은 관심의 특정 유전자를 위해 필요합니다.
마지막으로, 솔라리스 qPCR 분석 설계 알고리즘은 GC 콘텐츠, 길이, TM, 그리고 동질적인 세포핵의 펼쳐진 포함하여 중요한 설계 고려 사항에 대해 매우 엄격한 매개 변수를 사용합니다. 게놈, 성적 증명서, 그리고 pseudogene : 결과 시퀀스는 3 개의 데이터베이스를 사용하는 특이성에 대한 분석 BLAST 있습니다.

2. 솔라리스 시약 구하기

해당 솔라리스 시약을 얻으려면 다음 사이트를 방문 www.thermo.com / 솔라리스
일단 웹사이트에서 "GENEius 제품 검색"을 클릭합니다. GENEius 제품 검색로 바로 이동하려면 이동 www.thermo.com / SolarisSearch
검색 메세지 상자를 클릭하고 해당 대상 생물을 선택합니다.
GENEius 제품 검색은 다양한 유전자 식별자를 처리할 수 있습니다. 여기, 심판 Seq 가입, 유전자 ID, 진 심볼, 유전자 설명, 생거 ID 또는 가입 번호 또는 카탈로그 번호 등 관심의 유전자를 찾기 위해 제안된 검색어 중 하나를 입력합니다. 그런 다음, "검색"을 클릭하십시오.
관심있는 유전자를 확인하고 왼쪽에있는 '선택'을 클릭하십시오. 이것은 관심의 유전자에 사용할 수있는 다양한 써모 과학 제품을 보여주는 창이 열립니다. "제품"아래에있는 "qPCR 감지"탭을 선택합니다.
제목은 "솔라리스 유전자 발현 분석"에서, 당신은 하나가 최적 솔라리스 프로브 / 프라이머 분석 설계 볼 수 있습니다. 이 분석은 유전자 타겟의 모든 알려진 스플 라이스 변종을 커버합니다. 원하는 수량을 선택합니다. 그들은 100, 200, 400에서 사용할 수 있으며,
1,000 X 25 μl 반응 (분석이 만들어 주문으로 확인된 경우, 100 팩 크기는 사용할 수 없습니다.) "장바구니에 추가 '를 클릭하십시오.
다음 사용될 것입니다 열 자전거 타는 사람에 해당하는 마스터 믹스를 선택합니다. 마스터 믹스가 사용할 수있는 기계와 최고의 작품할지 결정하려면 클릭하십시오 '마스터 믹스가 PCR의 자전거 타는 사람과 가장 적합한 알아보십시오! "
사용하는 혼합 결정하기 위해 메뉴에서 사용됩니다 qPCR의 자전거 타는 사람을 찾습니다.
GENEius 제품 검색 창으로 돌아가기하고, 적절한 마스터 믹스를 선택합니다. 마스터 믹스 100, 200, 400, 1000 반응 사이즈된다. "장바구니에 추가"를 클릭하세요.
제안 참조 유전자와 뒷면 cDNA 합성 키트는 또한 완전한 qRT - PCR 분석을 위해 주문하실 수 있습니다.
솔라리스 qPCR의 시약이 도착하면, 사용할 준비가 때까지 -20 ° C에 그들을 저장할 수 있습니다. 다음 시약이 접수되어야합니다 : 800 200 NM NM, sequ에서 제공 각각 하나의 유전자 특정 프로브에서 제공이 primers을 포함 20X 솔루션을프로브 및 primers, 그리고 배 농도에서 솔라리스 qPCR의 유전자 발현 마스터 믹스 모두에 대한 정보를 줬어. 솔라리스 qPCR 진 표현 Assays은 12 개월의 최소 안정됩니다. 반복 동결은 해동하지 마십시오.

3. qPCR 설정

cDNA와 qPCR 프로토콜을 시작합니다. 총 RNA는 스핀 열 방법을 사용하여 추출해야합니다. 써모 과학 뒷면 cDNA 합성 키트 cDNA를 생성하기 위해 역방향 전송을 권장합니다.
primers, 프로브, 그리고 얼음 마스터 믹스를 해동하여 qPCR 준비. 또한 손으로에서 PCR 등급 물과 실시간 PCR의 감도를 향상시킬 수 있습니다 불투명 흰색 qPCR 접시를합니다.
1) 온습 시작의 DNA 중합 효소, DNA Thermoprime 효소의 핫 시작 버전 : 마스터 혼합을 포함한 실시간 PCR에 대한 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 효소의이 유형은 최대 반응 설정된 기간 동안 불특정 증폭을 방지하기 위해 사용하고 95에서 활성화 단계 ° C 15 분 필요합니다. 2) 솔라리스 마스터 믹스의 dNTPs는 dTTP는 솔라리스 입문서 / 프로브 assays와 함께 작동하도록 최적화된 독점적 반응 버퍼 증폭 효율 3), 최대화하기 위해 dUTP 대체합니다. 이 반응 버퍼 시약 및 플라스틱 사이의 대비를 증가 파란색 염료가 포함되어 있습니다. 4) ROX하여 qPCR 기기가 필요한 경우 ROX.
솔루션 해동 후에는 튜브를 (와동하지 않음) flicking하여 섞는다. 시약의 손실을 방지하기 위해 그들을 스핀.
다음 샘플의 숫자에 따라 스케일링을 관심의 유전자, 플러스 참조 유전자 하나에 대한 반응 믹스를 설정하는 15 ML 살균 팰컨 튜브를 준비합니다. 세 표준 곡선 방법은 분석에 사용되는 경우 템플릿 컨트롤 (NTC)와 표준 곡선 샘플도를 포함하지, 각 샘플을 준비할 수 복제 등 충분히 준비합니다.
96 잘 접시에 실행하는 각 샘플은 다음을 혼합 : 2X 솔라리스 qPCR 마스터 믹스 5 μL, 솔라리스 프리머 / 프로브 세트 (20X)의 0.5 μl, 그리고 PCR 학년 물을 같은 것을 최종 반응 부피 한번 cDNA 25 μL 것입 추가됩니다. 384 잘 접시에 실행하는 각 샘플에 대해 다음을 혼합 : 2X 솔라리스 qPCR 마스터 믹스의 12.5 μL, 솔라리스 프리머 / 프로브 세트 (20X)의 1.25 μl, 그리고 PCR 학년 물을 최종 반응 부피, 한 번 cDNA 것을 추가은 10 μL 것입니다.
멀티 채널 pipettor 사용하여 접시의 적절한 우물에 마스터 믹스를 전송할 수 있습니다. 마스터 믹스에 포함된 파란색 염료가 하얀 접시에 추적 pipetting 진행에 도움이됩니다. 그런 다음, 1-5 μL cDNA 템플릿 (96 잘 플레이트의 경우) 또는 cDNA 템플릿 1-2 μL를 (384 자 접시) 추가합니다. 믹스로 최대 피펫합니다. 원심 분리기에 접시를 놓고 이들은 형광 신호 방해하므로 모든 거품을 제거하는 스핀 다운.
프로그램 열 자전거 타는 사람 : 효소가 함께 활성화되어 있어야합니다 95 ° C 15 분 (1 사이클). 그렇다면 95의 40주기 ° C, 15 초 동안 변성 및 소둔 및 60 ° C 확장 60 초 동안.
qPCR 장비에서 접시를 놓습니다. 프로그램을 시작합니다.

솔라리스를 사용하는 대표 qPCR 결과

그림 1. PCR 효율과 R2의 값을 기준으로 판단으로 솔라리스 assays, 심지어 매우 낮은 입력 농도에서 안정적인 검색을 제공합니다. 합성 RNA의 amplicon 시퀀스 또는 DNA의 amplicon 시퀀스에서 합성된 cDNA의 열 10 배 dilutions는 각각 F2RL1 또는 CDC20에 대한 솔라리스 qPCR의 유전자 발현 분석을 사용하여 ABI 7900HT 악기에서 증폭되었다. 로그 스케일 증폭 곡선 및 표준 곡선은 효율성, R2 값, 10 log10 dilutions 밖으로 동적 범위 및 검출의 하한선을 포함하여 각 분석의 성능과 함께 표시됩니다.

그림 2. 솔라리스 Assays도 다른 연구자 및 연구소 간의 일관성있는 결과를 제공합니다. ALDOA 및 PPIB뿐만 아니라 비 타겟팅 제어 (NTC)를 대상으로 siRNAs는, 100, 10, 1, 0.1 nm의 최종 농도에서 헬라 세포로 transfected했다. 세포 수확 및 총 RNA는 48 시간 후 치료를 격리했다. cDNA는 써모 과학 뒷면 cDNA 합성 키트를 사용하여 합성되었다. cDNA의 나누어지는은 로체 LightCycler 480 (384 자) 플랫폼에서 ALDOA, PPIB, 그리고 GAPDH의 검출을위한 솔라리스 qPCR 진 표현 Assays를 사용하여 두 지리적으로 분리된 실험실에서 증폭되었다. 최저는 ΔΔCq 방법 (GAPDH 참조 유전자와 NTC - 처리 세포 정상화)를 사용하여 계산되었다. 최저의 동일한 수준이 두 사이트에서 두 연구자 사이의 유전자 목표를 모두 증명되었다.

Discussion

써모 과학 솔라리스 qPCR의 Assays는 qPCR 분석을 수행하기위한 간단하고 향상된 방법을 제공합니다. MGB 기술과 Superbases을 도입, 높은 엄중 알고리즘을 사용하여 이러한 프라이머 및 프로브 세트 qPCR 실험의 충실도 및 견고성이 극대화할 수 있습니다. 하나 프라이머 및 프로브 집합은 주어진 유전자의 모든 알려진 스플 라이스 변종을 인식합니다. 대상 사이트는 가능한 그 게놈 DNA가 증폭되지 않도록하기 위해 엑슨 걸치는 지역을 포함합니다. 이러한 기능은 가능한 크게 복잡한 실험을 수행하기 위해 필요한 시간을 줄이는 동시에 여러 샘플을 실행합니다. 마스터 혼합은 파란색 때문에 pipetting 추적을 잃지 않고, qPCR의 감도를 향상 백색 불투명 접시를 사용할 수 있습니다.

모두 합쳐 놓으면, 솔라리스 qPCR 분석의 설계 기능이 소설 qPCR 분석 구체적이고 강력한 모두있는 고성능 아직 단순하고 분석합니다.

Disclosures

이 문서의 저자는 써모 과학의 직원입니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics