Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Summary

O Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são novos pré-concebidas qPCR primer / sonda combinações projetado para simplificar o processo de qPCR sem sacrificar a especificidade e robustez do ensaio.

Abstract

O Solaris qPCR Assay expressão do gene é um novo tipo de primer / sonda conjunto, projetado para simplificar o processo de qPCR, mantendo a sensibilidade e precisão do ensaio. Estes conjuntos primer / sonda são pré-concebidos para> 98% dos genomas humano e do rato e melhorias característica importante das tecnologias anteriormente disponíveis. Estas melhorias foram possíveis em virtude de um algoritmo de design inovador, desenvolvido por especialistas Thermo Scientific bioinformática.

Várias características convenientes foram incorporados Ensaio qPCR Solaris para agilizar o processo de realizar quantitativa PCR em tempo real. Primeiro, o protocolo é semelhante ao de alternativas comumente empregados, por isso os métodos utilizados durante a qPCR são susceptíveis de ser familiar. Segundo, a mistura principal é azul, o que torna a configuração das reações qPCR mais fácil de rastrear. Em terceiro lugar, as condições de ciclos térmicos são os mesmos para todos os ensaios (genes), tornando possível para executar muitas amostras em um tempo e reduzindo o potencial de erro. Finalmente, a sonda e informações de seqüência de primer são fornecidos, simplificando o processo de publicação.

Aqui, nós demonstrar como obter os reagentes apropriados Solaris usando o recurso de busca GENEius produto encontrado no site da ordenação (www.thermo.com / solaris) e como utilizar os reagentes para a realização de qPCR Solaris usando o método de curva padrão.

Protocol

1. A Thermo Scientific Solaris qPCR Algorithm Design de Ensaio

1. O algoritmo usado no projeto de Solaris qPCR sonda / primer pares ajusta o Tm de cada componente permitindo assim condições de ciclismo universal. Incorporação do MGB, ou menor ligação groove, metade na sonda aumenta o Tm e permite sondas mais curto para ser projetado para uma maior flexibilidade de ensaio e performance. Como seu nome sugere, MGBs são uma classe de antibióticos que podem se encaixar no sulco menor da dupla hélice do DNA. MGBs são anexados ao final 3 ou 5 de uma sonda de DNA. Em solução, a fluorescência repórter FAM da sonda se apaga por Eclipse Refrescante Dark. Quando a sonda se liga a uma seqüência alvo, a mudança resultante em conformação a sonda s 3-D permite que um forte sinal fluorescente. Ligação da sonda de DNA para seqüência alvo é estabilizado pelo MGB, que permite o uso de altamente específicas, as sondas mais curtos, mantendo a temperatura de fusão apropriado para PCR. Assim, a detecção do sinal ocorre durante a fase de recozimento de amplificação do alvo. Durante a etapa de extensão, a sonda MGB desassocia ea fluorescência é novamente apagado. Porque a sonda desassocia, ela não afeta a eficiência da PCR.
2. Outra característica do algoritmo Solaris é o uso de Superbases. Superbases são modificados bases que têm maior capacidade de ligação para melhorar a estabilidade da AT títulos e eliminar GG auto-associação em guanina seqüências ricas. Além disso, eles não saciar fluoróforos adjacentes conectado no terminal 5. Estas bases são seletivamente colocada, de acordo com o algoritmo, para expandir a disponibilidade de seqüências-alvo. Isto torna possível a utilização de seqüências, tais como as regiões GC ricos, que poderiam ser evitados na elaboração de primers e sondas.
3. Sempre que possível, o algoritmo Solaris incorpora regiões junção exon abrangendo no site de destino. Isso aumenta a especificidade, evitando a amplificação do DNA genômico contaminante.
4. Importante, o algoritmo também identifica uma seqüência consenso para todas as variantes conhecidas de emenda, de modo que todos estão cobertos por uma única sonda / set primer. Assim, apenas um ensaio é necessário para um determinado gene de interesse.
5. Finalmente, o Solaris qPCR algoritmo projeto Ensaio utiliza parâmetros muito rigorosos para considerações de design críticas, incluindo o conteúdo GC, comprimento, Tm, e trechos de nucleotídeos homogênea. As seqüências resultantes são analisados ​​para a especificidade BLAST usando três diferentes bases de dados: genômica, transcrição e pseudogene.

2. Obtenção Solaris Reagentes

1. Para obter o apropriado Solaris reagentes, visite www.thermo.com / solaris
2. Uma vez no site clique em "Pesquisar Produto GENEius". Para ir diretamente para a busca de produtos GENEius, vá para www.thermo.com / SolarisSearch
3. Clique na caixa de pesquisa de pesquisa e escolha do organismo de destino apropriado.
4. A pesquisa de produtos GENEius pode processar muitos identificadores gene diferente. Aqui, entrar em um dos termos de pesquisa sugeriram para encontrar o gene de interesse, incluindo Ref Seq de Adesão, a identificação do gene, o Symbol Gene, uma descrição do Gene, o ID Sanger ou número de Adesão, ou um número de catálogo. Em seguida, clique em "Pesquisar".
5. Identificar o gene de interesse e clique em "Select" no lado esquerdo. Isto irá abrir uma janela que mostra os diferentes produtos Thermo Scientific disponíveis para o gene de interesse. Em "Produtos" selecione a opção "Detecção de qPCR" Tab.
6. Sob o título "Ensaio Expressão Gênica Solaris" título, você vai ver um bem concebido Solaris sonda / ensaio primer. Este ensaio vai cobrir uma emenda todas as variantes conhecidas de seu alvo gene. Escolha a quantidade desejada. Eles estão disponíveis em 100, 200, 400 e
   1000 X 25 mL reações (se o ensaio é identificado como made-to-order, o tamanho do pacote de 100 não estará disponível). Clique em "Add to Cart".
7. Em seguida, selecione o master mix apropriado para o termociclador que será usado. Para determinar qual master mix vai funcionar melhor com a máquina disponível, clique em "Saiba quais Mix Master funciona melhor com o seu Cycler PCR!"
8. Encontre o cycler qPCR que será usado no menu para determinar quais mix de usar.
9. Retornar à janela de busca de produtos GENEius, e selecione o master mix apropriado. O master mix vem em 100, 200, 400 e 1000 tamanhos reação. Clique em "Add to Cart".
10. Genes de referência propostos e kits verso cDNA síntese também pode ser encomendado para uma análise completa qRT-PCR.
11. Quando os reagentes Solaris qPCR chegam, armazená-los a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Os seguintes reagentes devem ser recebidos: Uma solução de 20X, contendo dois primers fornecidos a 800 nM cada e uma sonda gene específico previsto em 200 nm, sequinformações de referência para ambos os sonda e os primers e qPCR Gene Solaris Mix Master Expressão em uma concentração 2X. Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são estáveis ​​por um período mínimo de 12 meses. Evite congelar repetido descongelamento.

3. qPCR configuração

1. Iniciar o protocolo de qPCR com cDNA. RNA total deve ser extraído usando um método de coluna de spin. A Thermo Scientific Verso kit síntese de cDNA é recomendado para transcrição reversa para gerar cDNA.
2. Prepare-se para qPCR por descongelar os primers, sondas e master mix no gelo. Também tem em mãos PCR água grau e opaco placas qPCR branco, o que pode melhorar a sensibilidade do PCR em tempo real.
3. A mistura mestre contém todos os componentes para PCR em tempo real, incluindo: 1) DNA polimerase Thermo-Start, uma versão hot-início da DNA polimerase Thermoprime. Este tipo de polimerase é utilizada para prevenir não-específico de amplificação durante a reação, configurar e requer etapa de ativação de 95 ° C min 15. 2) dNTPs na mistura Mestre Solaris, dTTP substitui dUTP para maximizar a eficiência de amplificação 3) tampão de reação Proprietário, otimizado para trabalhar com Solaris primer / sonda ensaios. Este tampão de reação contém corante azul para aumentar o contraste entre reagente e plástico. 4) ROX, se o seu instrumento qPCR requer ROX.
4. Uma vez que as soluções têm descongelado, misture sacudindo o tubo (não vortex). Spin-los para baixo para evitar a perda de reagente.
5. Em seguida, preparar um tubo de 15 mL Falcon estéril para configurar o mix de reação para o gene de interesse, mais um para o gene de referência, ampliação, dependendo do número de amostras. Prepare o suficiente tal que três repetições podem ser preparados para cada amostra, incluindo um modelo de controle não (NTC) e as amostras de curva padrão, se o método de curva padrão será usado para análise.
6. Para cada amostra rodar em uma placa de 96 poços, misture o seguinte: 5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 0,5 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez o cDNA é adicionado será de 25 mL. Para cada amostra rodar em uma placa de 384 poços misturar os seguintes: 12,5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 1,25 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez que o cDNA é adicionado será de 10 mL.
7. Usando um pipetador multicanal, transferir a mistura de mestre para nos poços apropriados da placa. O corante azul incluídos no master mix vai ajudar no progresso de pipetagem de rastreamento nas placas brancas. Em seguida, adicionar o template 1-5 mL cDNA (para uma placa de 96 poços) ou 1-2 mL de modelo de cDNA (para uma placa de 384 poços). Pipeta cima e para baixo para misturar. Coloque a placa em uma centrífuga e spin para baixo para remover as bolhas, pois estas irão interferir com as leituras de fluorescência.
8. Programa do termociclador: A enzima deve ser ativado com um 95 ° C 15 min (1 ciclo). Em seguida, 40 ciclos de 95 ° C, a desnaturação por 15 segundos, e recozimento e extensão a 60 ° C por 60 segundos.
9. Coloque a placa no instrumento qPCR. Iniciar o programa.

Resultados representativos qPCR usando Solaris

Figura 1. Ensaios Solaris dar a detecção confiável, mesmo em concentrações muito baixas de entrada, a julgar pela eficiência da PCR e valores r2. 10 dez diluições de cDNA sintetizado a partir seqüência sintética amplicon RNA ou DNA seqüência amplicon foi amplificado em um instrumento 7900HT ABI usando Solaris qPCR Assay Expressão Gênica para F2RL1 ou CDC20, respectivamente. As curvas de log escala de amplificação e curvas de nível são mostrados juntamente com o desempenho de cada ensaio, incluindo a eficiência, o valor de r2, faixa dinâmica de 10 log10 diluições, eo limite mínimo de detecção.

Figura 2. Assays Solaris dar resultados consistentes até mesmo entre diferentes pesquisadores e laboratórios. siRNAs segmentação ALDOA e PPIB, bem como um controle não-alvo (NTC), foram transfectados em células HeLa em 100, 10, 1 e 0,1 nM concentrações final. As células foram colhidas e RNA total isolado 48 horas pós-tratamento. cDNA foi sintetizado usando Thermo Scientific Verso Kit Síntese de cDNA. Uma alíquota do cDNA foi amplificado em dois laboratórios separados geograficamente usando Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica para a detecção de ALDOA, PPIB, e GAPDH em um LightCycler Roche 480 (384 poços) da plataforma. Knockdown foi calculado usando o método ΔΔCq (normalizados para GAPDH referência gene e NTC tratados com células). Os mesmos níveis de knockdown foram demonstradas para alvos tanto gene entre os dois pesquisadores em ambos os locais.

Discussion

Thermo Scientific Ensaios Solaris qPCR fornecer um método simples e melhor para a realização de análise de qPCR. Usando um algoritmo de alta severidade, incorporando tecnologia e MGB Superbases, esses conjuntos de primers e sonda maximizar a fidelidade ea robustez dos experimentos qPCR. Uma cartilha e definir sonda reconhece todas as variantes conhecidas emenda de um determinado gene. O site de destino, sempre que possível, inclui as regiões exon abrangendo, para garantir que o DNA genômico não é amplificado. Estas características tornam possível executar várias amostras simultaneamente, reduzindo a quantidade de tempo necessário para realizar experimentos complexos. Desde a mistura principal é azul, é possível usar placas brancas opacas, que melhoram a sensibilidade do qPCR, sem perder de vista a pipetagem.

Tomados em conjunto, as características do projeto do Ensaio qPCR Solaris fazer este ensaio qPCR romance um ensaio simples, mas de alto desempenho que é específica e robusta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo Fisher Scientific, Inc.	AB-1170	50 sheets
*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay
**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics