تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

Summary

تصور

Abstract

RNA الترجمة هي آلية الحفظ إنشاء خلية قطبية. Vg1 مرنا يموضع إلى القطب نباتية من البويضات القيطم المورق ويعمل على تقييد مكانيا التعبير الجيني للVg1 البروتين. مطلوب رقابة مشددة من Vg1 التوزيع بهذه الطريقة المناسبة لمواصفات طبقة الجرثومية في الجنين النامية. تسلسل الحمض النووي الريبي العناصر في UTR 3 'من مرنا ، وتوطين عنصر Vg1 (VLE) هي المطلوبة والكافية لنقل المباشر. لدراسة الاعتراف ونقل Vg1 مرنا في الجسم الحي ، قمنا بتطوير تقنية التصوير التي تسمح للتحليل واسعة من العوامل عبر آليات النقل الموجهة عبر قراءات بصرية بسيطة.

الحمض النووي الريبي لتصور التعريب ، ونحن توليف fluorescently المسمى VLE RNA وهذا نص في microinject البويضات الفردية. ثقافة البويضة بعد للسماح بنقل الحمض النووي الريبي حقن ، البويضات يتم إصلاحها والمجففة قبل التصوير بواسطة المجهر مبائر. تصور أنماط توطين مرنا يتيح قراءة لرصد المسار الكامل لنقل الحمض النووي الريبي وتحديد الأدوار في توجيه نقل الحمض النووي الريبي لرابطة الدول المستقلة المفعول عناصر داخل النص ، والعوامل التي تعمل عبر ربط VLE (لويس وآخرون ، 2008 ، Messitt وآخرون ، 2008). لقد قدمنا ​​من خلال هذه التقنية بالتعاون مع التعريب الرناوات إضافية والبروتينات (غانيون وموري ، 2009 ، Messitt وآخرون ، 2008) ، وبالاشتراك مع تعطل المحرك والهيكل الخلوي البروتينات و(Messitt وآخرون ، 2008) إلى التحقيق الآليات الكامنة وراء توطين مرنا.

Protocol

الجزء 1 : النسخ من مرنا fluorescently المسمى.

1. يصبح خطي DNA البلازميد التي تحتوي على عنصر أو تسلسل الحمض النووي الريبي التعريب الأخرى ذات الصلة وresuspend في 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع DEPC المعاملة O. ₂ H يجب أن يكون القالب الحمض النووي لديها مواقع المروج المنبع للنسخ التي T7 ، SP6 ، أو T3 بوليميريز الحمض النووي الريبي.
2. إضافة الكواشف التالية لأنبوب 1.5mL العقيمة :

   أ. 10X تكساس العازلة (انظر M & M)	2 ميكرولتر
   ب. 20X قبعة / مزيج NTP (انظر M & M)	1 ميكرولتر
   ج. 1 ملم اليكسا فلور 546-14 - UTP (Invitrogen)	1 ميكرولتر
   د. UTP ، [α P - 32] (1 μCi / ميكرولتر) (بيركن إلمر)	1 ميكرولتر
   ه. DEPC - H 2 O	11 ميكرولتر
   ف. 0.2 M DTT	1 ميكرولتر
   ز RNasin (Promega)	1 ميكرولتر
   ح. الخطي قالب الحمض النووي	1 ميكرولتر
   ط رنا بوليميريز (Promega)	1 ميكرولتر

3. المزيج بلطف والكواشف الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 ثانية. في microcentrifuge).
4. احتضان لمدة 2-4 ساعات في 37 درجة مئوية ، وتغطي الأنبوب برقائق الألومنيوم لمنع photobleaching من fluorophore.
5. إضافة 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل ريبونوكلياز خالية الدناز (Promega) للحط من الحمض النووي القالب.
6. احتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
7. إضافة 79 ميكرولتر 20 ملي EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) لوقف التفاعل.
8. 1 ميكرولتر لإزالة أنبوب منفصل ، وصفت بانها "المدخلات" وانقاذ.
9. رد الفعل من خلال زيادة ونقصان عمود G50 1 مل (انظر المواد والطرق) ، والتي سوف تشمل النيوكليوتيدات الفردية مع استبعاد كامل مرنا طول.
10. تركيز الحمض النووي الريبي قبل هطول الأمطار الايثانول :
    1. إضافة 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 10 ميكرولتر 7M COONH CH _{3 4} ، 1 ميكرولتر RNA الناقل (الحمض الريبي النووي النقال الخميرة ، و 10 ميكروغرام / ميكرولتر) أو 1 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل).
    2. وتخلط جيدا حتى تجميد الصلبة في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة> أو على الجليد الجاف لمدة 15 دقيقة.
    3. تدور في أقصى سرعة في microcentrifuge لمدة 15 دقيقة ، وطاف صب.
    4. يغسل مع 150 ميكرولتر من الايثانول 75 ٪.
    5. تدور لمدة 3 دقائق على السرعة القصوى في طاف ، microcentrifuge صب.
    6. تجفيف بيليه في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، وضمان أن جميع الايثانول قد تبخرت.
11. Resuspend في 11 ميكرولتر DEPC O ₂ - H وإزالة 1 ميكرولتر لأنبوب منفصل ، وصفت بانها "دمج".
12. تحديد التأسيس في المئة وتخفيف الحمض النووي الريبي إلى 50 نانومتر (انظر المواد وطرق الحساب).
13. ينبغي تجميد الحمض النووي الريبي في 5 aliquots ميكرولتر ، لاستخدام مرة واحدة لتجنب تجميد / الذوبان الدورات ويمكن تخزينها لعدة أسابيع في -80 درجة مئوية.

الجزء 2 : التحضير لMicroinjection.

1. RNA التحضير :
   أذاب an قسامة من الحمض النووي الريبي (50 نانومتر) ، وتفسد الحمض النووي الريبي في 70 دقيقة لمدة 3-5 درجة مئوية. تدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة microcentrifuge بأقصى سرعة ممكنة لإزالة أي الجسيمات ، والحفاظ على الجليد.
2. البويضة التحضير :
   1. إزالة المبيض جراحيا من الإناث المورق القيطم (ناسكو).
   2. تقليم قطعة من المبيض المورق القيطم في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز (انظر المواد والطرق).
   3. يهز بلطف عند 18 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أو حتى يتم فصل واضح البويضات من المبيض. بسبب دفعي لتباين الدفعي ، قد كولاجيناز وقت المعالجة تختلف ، وينبغي رصدها بعناية من خلال الفحص البصري لضمان defoliculation.
   4. السماح لتسوية البويضات في أنبوب ، وإزالة حل ويغسل البويضات مع العازلة MBSH (انظر المواد والطرق).
   5. تكرار غسل مرتين أكثر من أجل ما مجموعه ثلاثة يغسل. هذا البروتوكول العزلة البويضة هي مماثلة لتلك المفصلة في كوهين وآخرون ، 2009.
   6. الفرز يدويا في المرحلة الثالثة / البويضات الرابع (دومون ، 1972) في MBSH العازلة تحت المجهر القياسية تشريح. المرحلة الثالثة هي البويضات مبهمة تماما لكنها بيضاء ، في حين أن المرحلة الرابعة البويضات هي أكبر قليلا ، وتتخللها الصباغ. البويضات تكون شفافة قليلا جدا من الشباب والبويضات التي المصطبغة كليا أو توزيع يحمل صبغة الاستقطاب قديمة جدا.
3. إبرة التحضير :
   سحب وشطبة الإبر إلى القطر الخارجي من 0.05 ملم ~. (ونحن نستخدم العلم دروموند 3.5 بوصة الشعيرات الدموية (ترتيب # 3 - 000 - 203 - G / X) ، وهو الصك سوتر micropipette مجتذب شركة وشركة beveller WPI).

الجزء 3 : Microinjection

1. معايرة الإبرة مع O ₂ DEPC - H 2 لتسليم NL في الحقن. نحن لدينا تحميل الجبهة باستخدام إبرة microinjector الغاز يحركها (انظر المواد والطرق) ، وانخفاض حجم معايرة باستخدام ميكرومتر.
2. تحميل RNA في الإبرة.
3. مكان فرز البويضات في طبق يحتوي على حقن MBSH العازلة. نحن microinject على طبق مع طبقة من المطاط الرغوي السوداء. والبويضات شاحب تبرز بشكل جيد على backgrou الأبيضالثانية.
4. حقن البويضة مع كل بعناية NL 2 من الحمض النووي الريبي في 50 نانومتر.
5. طرد الجيش الملكي النيبالي ، وشطف مع إبرة DEPC O ₂ - H ، وتحميل RNA المقبل للحقن.

الجزء 4 : ثقافة سيت

1. البويضات مكان في بئر من 24 لوحة معقمة جيدا (سيغما الدريتش). نحن ثقافة ما يصل الى ألف البويضات لكل بئر.
2. إزالة العازلة واستبدالها مع 400 ميكرولتر O ocyte C M ulture edium (OCM ، انظر المواد و المناهج) لكل بئر. مكان لوحة الثقافة داخل حاوية بلاستيكية محكمة الغلق مع منشفة ورقية مبللة للحفاظ على بيئة رطبة خلال الثقافة.
3. احتضان البويضات عند 18 درجة مئوية لمدة تتراوح من النقاط الزمنية ما بين 8 و 48 ساعات.

الجزء 5 : التثبيت والجفاف وتخزين البويضات

1. فرز البويضات أي ميت على قيد الحياة ومكان البويضات في قوارير زجاجية. نلاحظ بشكل روتيني> البقاء على قيد الحياة 90 ٪.
2. البويضات في مكان مثبت MEMFA (انظر المواد والطرق) والصخور لمدة 20 دقيقة. حماية البويضات من الضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
3. غسل البويضات عن طريق إزالة تثبيتي ، والاستعاضة عن حجم مساو من MBSH العازلة. كرر هذا مرة أخرى ليغسل ما مجموعه اثنين من يغسل.
4. غسل البويضات في الميثانول اللامائية :
   1. إزالة نصف الحجم ، مع استبدال الميثانول.
   2. كرر الخطوة "أ" مرتين.
   3. إزالة جميع من الحل ، مع استبدال الميثانول.
   4. تكرار غسل الميثانول.
5. ويمكن تخزين البويضات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للصورة.

الجزء 6 : التصوير RNA التعريب بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

1. قبل التصوير ، إضافة ليالي غرفة متوسطة موراي (2:1 بنزيل بنزوات البنزيل الكحول -) إلى أسفل الزجاج FluoroDish (WPI شركة) لتغطية السطح التصوير.
2. نقل بعناية البويضات من الميثانول إلى FluoroDish ، والتقليل من حجم نقل الميثانول.
3. الصورة على المجهر an مبائر المقلوب (ونحن قد استخدمت بنجاح LSM510 زايس وTCS SP2 لايكا).

الشكل 1 :.. يقتصر في البداية تصور التعريب بواسطة الحمض النووي الريبي التحت خلوية Microinjection النصوص صفتها Fluorescently ألف microinjection التالية ، RNA المسمى مع فلور اليكسا 546 إلى النواة باء بعد ثماني ساعات من الثقافة ، ويمكن أن ينظر إلى fluorescently المسمى RNA السيطرة بشكل موحد وزعت في سيتوبلازم البويضة. جيم ومع ذلك ، يمكن أن ينظر إلى RNA fluorescently المسمى تحتوي على تسلسل التي تجند أجهزة النقل في عملية توطين التحت خلوية إلى القطب نباتية من البويضة (نحو الأسفل). مقياس بار = 50 ميكرومتر.

Discussion

هنا قدمنا ​​مشروع بروتوكول لتصور التعريب مرنا في القيطم البويضات. هذا الأسلوب ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي fluorescently المسمى النصوص وأعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء من الحصول مسبقا مع digoxigenin المسمى النصوص وأبسط وأسرع من الوضع الطبيعي في النهج القائمة (موري وميلتون ، 1992 ، Gautreau وآخرون ، 1997). باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا مهندس تسلسل الحمض النووي الريبي واختبار الطفرات بسرعة على وظيفة في الجسم الحي. كذلك ، باستخدام إضافية اليكسا - UTP fluorophores ، يمكن تصور عدة أنواع الحمض النووي الريبي في البويضة نفسها. لقد وجدنا أن في اليكسا القيطم فلور البويضات 546-14 - UTP يعطي نتائج متفوقة بالمقارنة مع فلور اليكسا 488-5 - UTP بسبب تألق ذاتي في النطاق الموجي 488 نانومتر ، ولكن ، والتصوير المزدوج اثنين من الممكن مع ذلك الرناوات (غانيون و موري ، 2009). أيضا ، هذه التقنية تعمل بشكل جيد بالتعاون مع بروتوكولات immunostaining للكشف عن البروتين colocalization ، وتشكيلة واسعة من الأجسام المضادة متوافق الثانوية الفلورية المتاحة (يون وموري ، 2006 ، Messitt وآخرون ، 2008). أخيرا ، يمكن الجمع بين اختلال عملية التوطين من خلال التعبير عن RNA أكثر من العوامل السلبية الغالبة أو جزيء صغير تدخل مع هذا الاختبار لتصور عيوب خفية في مسار التعريب مرنا (Messitt وآخرون ، 2008). وقد أثبتت هذه التقنية لتكون تجربة بسيطة نسبيا وقوية للكشف عن توزيع مرنا في الجسم الحي ، ويمكن دمجها بسهولة في القائمة التقنيات الحيوية والبيولوجية الجزيئية والخلوية لبحث آليات النقل مرنا.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.