머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

Summary

의 시각화

Abstract

RNA의 지방화는 세포 극성을 설립의 보존 메커니즘입니다. Vg1 mRNA는 Xenopus laevis oocytes과 공간의 Vg1 단백질의 유전자 발현을 제한하는 행위의 식물 극을 localizes. 이러한 방식으로 Vg1 배포 꽉 제어는 개발 배아에서 적절한 세균 계층 사양이 필요합니다. mRNA의 3 'UTR에서 RNA의 시퀀스 요소는 Vg1 지역화 요소 (VLE)가 필요하며 직접 전송하기에 충분합니다. 생체내에 Vg1 mRNA의 인식 및 전송을 연구하기 위해, 우리는 단순한 시각적인 판독을 통해 트랜스 팩터 감독 전송 메커니즘의 광범위한 분석을 수있는 이미징 기술을 개발했습니다.

RNA의 지방화를 시각화하기 위해, 우리는 찬란 표시 VLE의 RNA를 합성하고 개별 oocytes에 대한 본 사항이 명시를 microinject. 주입된 RNA의 전송을 허용하는 oocyte 문화 후, oocytes 사전 공촛점 현미경으로 영상을 고정하고 탈수 있습니다. mRNA의 현지화 패턴의 시각화는 RNA 수송의 전체 경로를 모니터링 및 CIS - 행동 VLE (루이스 외., 2008에 바인딩 증명서 및 횡단 행동 요소 내의 요소에 대한 RNA 수송 감독의 역할을 식별에 대한 기록을 제공합니다 Messitt 외., 2008). 우리는 추가 RNAS과 단백질 (가뇽과 마우리, 2009 Messitt 외., 2008)와 함께 공동 지방화를 통해이 기술을 확장 있고, 모터 단백질의 파괴와 cytoskeleton와 함께 (Messitt 외., 2008) 탐침을 mRNA의 지방화를 기본 메커니즘.

Protocol

1 부 : 찬란 라벨 mRNA의 전사.

1. RNA의 현지화 요소 또는 기타 관련 시퀀스를 포함하는 플라스미드 DNA를 Linearize 및 DEPC - H ₂ O. 처리 1 μg / μl에 resuspend DNA 템플릿은 T7, SP6 또는 T3 RNA 효소에 의해 해독을위한 업스트림 발기인 사이트가 있어야합니다.
2. 멸균 1.5mL 튜브에 다음 시약을 추가합니다 :

   A. 10X TX 버퍼 (M & M 참조)	2 μl
   B. 20X 모자 / NTP 믹스 (M & M 참조)	1 μl
   C. 1 ㎜ 알렉사 플루어 546-14 - UTP (Invitrogen)	1 μl
   D. UTP, [α - 32 P] (1 μCi / μl) (퍼어킨 엘머)	1 μl
   E. DEPC - H 2 O	11 μl
   F. 0.2 M DTT	1 μl
   G. RNasin (Promega)	1 μl
   H. 선형 템플릿 DNA	1 μl
   I. RNA 효소 (Promega)	1 μl

3. 부드럽게 시약을 혼합하고 (10 초. microcentrifuge에서) 잠깐 원심 분리기.
4. 형광단의 photobleaching 방지하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 37 ° C에서 2~4시간을위한 부화.
5. 템플릿 DNA이 저하될 1 μl 1 MG / ML RNase 무료 DNase (Promega)를 추가합니다.
6. 37 15 분 품어 ° C.
7. 반응을 중지 79 μl 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)를 추가합니다.
8. "입력"과 저장라는 별도의 튜브, 1 μl를 제거합니다.
9. 전체 길이 mRNA를 제외한 동안 비법인 세포핵을 포함하는 1 ML G50 칼럼을 통해 스핀 반응 (재료 및 방법 참조).
10. 에탄올 침전으로 RNA를 집중 :
    1. 250 μl 100 % 에탄올, 10 μl은 7m CH ₃ COONH _4, 1 μl 캐리어 RNA (tRNA 효모, 10 μg / μl) 또는 1 μl 글리코겐 (20 MG / ML) 추가합니다.
    2. 잘 믹스하여 -80에서 고체까지 동결 ° C> 30 분 또는 15 분 동안 드라이 아이스에.
    3. 15 분 가만히 따르다 뜨는 위해 microcentrifuge의 최대 속도로 회전.
    4. 75 % 에탄올 150 μl로 씻으십시오.
    5. microcentrifuge, 가만히 따르다 뜨는의 최대 속도로 3 분 스핀.
    6. 모든 에탄올이 증발했다는 보장, 3 분 동안 37 ° C 펠릿 건조.
11. 11 μl DEPC - H ₂ O의 Resuspend 및 "포함"으로 표시 별도의 튜브, 1 μl를 제거합니다.
12. %의 설립을 결정하고 (재료 및 계산 방법을 참조하십시오) 50 nm의로 RNA를 희석.
13. RNA는 동결 / 해동 사이클을 피하기 위해 단일 ​​사용 5 μl aliquots에 냉동이어야하며 -80 ° C.에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다

2 부 : Microinjection 준비.

1. RNA 준비 :
   RNA (50 NM)의 나누어지는를 해동하고, 70 RNA를 변성 ° C를 3~5분하십시오. 모든 입자를 제거하고, 얼음을 유지하는 최대 속도에서 실내 온도 microcentrifuge에서 10 분 스핀.
2. Oocyte 준비 :
   1. 수술 Xenopus laevis 여성 (Nasco)에서 난소를 제거합니다.
   2. Collagenase 솔루션 25 ML을 포함한 50 ML 원뿔 관에 Xenopus laevis의 난소의 트림 조각 (재료 및 방법 참조).
   3. 15 분 동안 18 ° C에서 부드럽게 흔들거나 oocytes까지 가시 난소에서 구분됩니다. 배치 변화로 배치로 인해, collagenase 처리 시간은 다를 수 있으며 defoliculation을 보장하기 위해 육안 검사를 통해 신중하게 모니터링해야합니다.
   4. oocytes가 튜브에 정착하도록 허용, 솔루션을 제거하고 (재료 및 방법 참조) MBSH 버퍼로 oocytes 씻으십시오.
   5. 세 세척 총 두 번 더 씻어 반복합니다. 이 oocyte 격리 프로토콜 코헨 외., 2009에 대한 자세한 비슷합니다.
   6. 표준 해부 현미경 MBSH 버퍼에 수동 정렬 스테이지 III / IV oocytes (뒤몽, 1972). 단계 IV의 oocytes는 안료와 약간 크고 스페클드하는 동안 스테이지 III의 oocytes 완전히 불투명하지만 흰색입니다. 약간 투명 Oocytes 완전히 색소 또는 전시 편광 안료 배포가 너무 오래, 너무 젊은 oocytes 있습니다.
3. 니들 준비 :
   ~ 0.05 mm의 외경에 바늘을 당겨와 베벨. (우리는 드루먼드 과학 3.5 인치 모세관을 사용하여 (주문 # 3 - 000-203 - G / X), 셔터 악기 (주) micropipette 풀러와 WPI 주식 beveller.)

파트 3 : Microinjection

1. 사출 당 2 NL를 제공하기 위해 DEPC - H ₂ O와 바늘을 보정합니다. 우리는 앞에서 가스 구동 microinjector을 (재료 및 방법 참조)를 사용하여 우리의 바늘을로드하고 마이크로 미터를 사용하여 드롭 크기를 보정.
2. 바늘로 RNA를로드합니다.
3. 장소 MBSH 버퍼를 포함하는 주입 그릇에 oocytes를 정렬. 우리는 검은 거품 고무의 레이어와 함께 접시에 microinject. 창백한 oocytes는 흰색 backgrou에 잘 눈에 띄는ND.
4. 조심스럽게 50 NM에서 RNA 2 NL 각 oocyte를 삽입.
5. , RNA DEPC - H ₂ O와 바늘을 씻어하고, 주사에 대한 다음 RNA를 부하를 추방.

4 부 : Oocyte 문화

1. 멸균 24 잘 플레이트 (시그마 알드리치)의 우물에 플레이스 oocytes. 물론 당 천 oocytes에 우리 문화를 백업하십시오.
2. 버퍼를 제거하고 400 μl O ocyte C ulture M edium로 교체 (OCM, 재료 및 방법 참조) 잘마다. 문화 중에 촉촉한 환경을 유지하기 위해 서부 유럽 표준시 종이 타월로 빵빵한 플라스틱 컨테이너 안의 문화 플레이트 플레이스.
3. 18 ° C 8 및 48 시간 사이에 이르기까지 시간이 지점에 대한 oocytes를 품어.

제 5 부 : Oocytes의 고정, 탈수 및 저장

1. 어떤 죽은 oocytes를 정렬 및 유리 튜브에서 살아남기 oocytes를 배치합니다. 우리는 일상적으로> 90 % 생존을 관찰.
2. MEMFA 정착액 (재료 및 방법 참조) 20 분 바위 플레이스 oocytes. 알루미늄 호일로 덮고하여 빛으로부터 oocytes를 보호합니다.
3. 정착액을 제거하고 MBSH 버퍼의 동일한 볼륨 대체하여 oocytes 씻으십시오. 이 세척의 총 한 번 더이 세차를 반복합니다.
4. 무수 메탄올에 oocytes 씻으십시오 :
   1. 볼륨의 절반을 제거 메탄올로 바꿉니다.
   2. "A"두 단계를 반복합니다.
   3. 솔루션의 모든 제거 메탄올로 바꿉니다.
   4. 메탄올 세척을 반복합니다.
5. Oocytes는 이미지를 준비하기 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

6 부 : 공촛점 현미경으로 영상 RNA의 현지화

1. 이미징 전에 이미지 표면을 커버하기 위해 유리 바닥 FluoroDish (WPI 주)에 머리 S 지우기 매체를 (2시 1분 벤질 벤조 산 벤질 알코올 -) 추가합니다.
2. 조심스럽게 양도 메탄올의 볼륨을 최소화, 메탄올에서 FluoroDish로 oocytes을 전송하기만하면됩니다.
3. 거꾸로 공촛점 현미경에 이미지 (우리는 성공적으로 자이스 혈구 LSM510와 Leica TCS SP2를 사용했습니다.)

그림 1 :.. 찬란 Labelled 성적 Microinjection하여 Subcellular RNA 현지화의 시각화 알렉사 플루어 546으로 표시 A. 따라 microinjection, RNA가 처음에 핵에 제한됩니다 B.이 문화 여덟 시간 후, 찬란 표시 제어 RNA가 균일하게 볼 수 있습니다 oocyte의 세포질에서 배포. C. 그러나, 수송 기계를 모집 해당 시퀀스를 포함하는 찬란 표시된 RNA가 oocyte (아래 방향)의 식물 극에 subcellular 지방화의 과정에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm의.

Discussion

여기 우리는 Xenopus의 oocytes에서 mRNA의 현지 시각을위한 프로토콜을 제시했습니다. 이 방법은, 찬란 표시 RNA의 성적표를 사용하면 이전에 dig​​oxigenin - 표시된 성적표와 함께 취득하고 간단하고 원위치 기반 접근법 (마우리과 멜튼, 1992, 고터오 외., 1997)보다 빠르고보다 노이즈 비율 높은 신호를했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 엔지니어 순서 변이를 RNA 빠르게 생체내 기능에 대해 테스트할 수 있습니다. 또한, 추가 알렉사 - UTP의 fluorophores을 사용하여 여러 RNA 종 같은 oocyte에서 시각하실 수 있습니다. 우리는 알렉사 플루어 488-5 - UTP 때문에 488 나노미터 파장 범위에서 autofluorescence의과 비교 Xenopus oocytes 알렉사 플루어에 546-14 - UTP이 우수한 결과를 제공 것으로 나타났습니다 있으나 두 RNAS의 듀얼 이미징은 (가뇽과 그럼에도 불구하고이 가능합니다 마우리 2009). 또한이 기술은 단백질 colocalization을 감지 immunostaining 프로토콜과 함께 작동이 잘 호환되는 형광 이차 항체의 다양한으로 (윤과 마우리, 2006, Messitt 외., 2008) 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 지배적인 부정적 요인 또는 작은 분자 간섭 이상의 표현을 통해 RNA의 지방화 과정의 장애는 mRNA의 로컬 라이제이션 경로의 미묘한 결함을 (Messitt 외., 2008) 시각화이 분석과 함께하실 수 있습니다. 이 기술은 생체내에서 mRNA의 분포를 검출 비교적 단순하고 강력한 분석으로 입증하고 mRNA 수송의 메커니즘을 탐색하는 기존 생화학, 분자 및 세포 생물 학적 기술에 쉽게 통합될 수 있습니다.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.