Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

Summary

Visualização de

Abstract

Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 'UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples.

Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.

Protocol

Parte 1: Transcrição de mRNA fluorescente etiquetado.

1. Linearizar DNA plasmídeo contendo o elemento de localização RNA ou seqüência relevante e ressuspender em 1 mcg / mL com DEPC tratadas com H ₂ O. O modelo de DNA deve ter sites de promotor a montante para a transcrição de T7, SP6, ou RNA polimerase T3.
2. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo de 1,5 ml estéril:

   a. 10X Tx buffer (ver M & M)	2 l
   b. 20X cap / NTP mix (ver M & M)	1 ml
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 ml
   d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / mL) (Perkin Elmer)	1 ml
   e. DEPC-H 2 O	11 mL
   f. 0,2 M DTT	1 ml
   g. RNasin (Promega)	1 ml
   h. DNA modelo linear	1 ml
   i. RNA polimerase (Promega)	1 ml

3. Misture delicadamente os reagentes e centrifugar brevemente (10 seg. Numa microcentrífuga).
4. Incubar por 2-4 horas a 37 ° C, cobrindo o tubo com papel alumínio para evitar fotodegradação de fluoróforo.
5. Adicionar 1 ml 1 mg / ml RNase DNase (Promega) para degradar DNA template.
6. Incubar 15 minutos a 37 ° C.
7. Adicionar 79 mL 20 mM EDTA (pH 8,0) para parar a reação.
8. Retire 1 ml para um tubo separado, rotulados como "input" e salve.
9. Reação através de um spin-1 ml G50 coluna (ver Materiais e Métodos), que incluirá unincorporated nucleotídeos, excluindo mRNA de corpo inteiro.
10. Concentrar o RNA por precipitação de etanol:
    1. Adicionar 250 mL de etanol 100%, 10 ml 7M CH ₃ COONH _4, 1 ml transportadora RNA (tRNA levedura, 10 mcg / mL) ou 1 mL de glicogênio (20 mg / ml).
    2. Misture bem e leve ao freezer até sólida a -80 ° C durante> 30 minutos ou em gelo seco por 15 minutos.
    3. Giram em velocidade máxima em microcentrífuga por 15 minutos, decantar o sobrenadante.
    4. Lavar com 150 mL de etanol 75%.
    5. Rodada por 3 minutos na velocidade máxima em microcentrífuga sobrenadante, decantar.
    6. Secar o pellet a 37 ° C por 3 minutos, garantindo que todo o etanol tenha evaporado.
11. Ressuspender em 11 mL DEPC-H ₂ O e remover 1 ml para um tubo separado, rotulados como "incorporados".
12. Determinar a incorporação por cento e diluir o RNA a 50 nM (ver Materiais e Métodos de cálculo).
13. O RNA devem ser congeladas em 5 alíquotas mL, para uso único para evitar congelamento / descongelamento e pode ser armazenado por várias semanas a -80 ° C.

Parte 2: Preparando-se para microinjeção.

1. Preparação RNA:
   Descongelar uma alíquota de RNA (50 nM), e desnaturar a RNA a 70 ° C por 3-5 minutos. Giro por 10 minutos em microcentrífuga a temperatura ambiente na velocidade máxima para remover quaisquer partículas, e continuar a gelo.
2. Preparação de ovócitos:
   1. Remover cirurgicamente ovário de Xenopus laevis fêmeas (Nasco).
   2. Peças de acabamento de Xenopus laevis ovário em um tubo de 50 ml contendo 25 ml de solução de colagenase (ver Materiais e Métodos).
   3. Agitar suavemente a 18 ° C por 15 minutos, ou até oócitos são visivelmente separados do ovário. Devido à variação entre lotes, colagenase tempo de tratamento pode variar e devem ser cuidadosamente monitorizados através de inspeção visual para garantir defoliculation.
   4. Permitir oócitos para se instalarem no tubo, retire da solução e lave os ovócitos com tampão MBSH (ver Materiais e Métodos).
   5. Repita mais duas vezes para lavar um total de três lavagens. Este protocolo de isolamento de oócitos é semelhante ao detalhado em Cohen et al., 2009.
   6. Classificar manualmente estágio III / IV oócitos (Dumont, 1972) em tampão MBSH sob um microscópio padrão de dissecação. Oócitos fase III estão completamente opaco, mas branco, enquanto ovócitos estágio IV são ligeiramente maiores e salpicado com pigmento. Oócitos que são ligeiramente transparentes são demasiado jovens e ovócitos que totalmente pigmentadas ou apresentam distribuição do pigmento polarizada são muito antigas.
3. Preparação da agulha:
   Puxe e bisel agulhas para um diâmetro externo de ~ 0,05 mm. (Nós usamos Drummond Científico de 3,5 polegadas capilares (ordem # 3-000-203-G / X), um Instrumento de Sutter Co. micropipeta extrator e um WPI Inc. beveller.)

Parte 3: microinjeção

1. Calibrar agulha com DEPC O _2-H para entregar 2 nl por injeção. Nós frente a nossa carga usando uma agulha microinjetor gás-driven (ver Materiais e Métodos), e calibrar o tamanho da gota usando um micrômetro.
2. Carga RNA em agulha.
3. Lugar classificadas oócitos em um prato de injeção contendo tampão MBSH. Nós microinject em um prato com uma camada de espuma de borracha preta. Os oócitos pálida se destacam bem em um backgrou brancond.
4. Cuidadosamente cada injetar oócitos com 2 nl de RNA em 50 nM.
5. Expulsar RNA, lavar a agulha com DEPC O _2-H, e carregar RNA próxima injectável.

Parte 4: Cultura de oócitos

1. Oócitos lugar em um poço de uma placa de 24 estéreis bem (Sigma Aldrich). Nós cultura até mil oócitos por poço.
2. Remover e substituir tampão com 400 mL O ocyte ULTURA C M edium (OCM; ver Materiais e Métodos) por poço. Coloque placa de cultura dentro de um recipiente hermético plástico com toalha de papel molhado para manter o ambiente úmido durante a cultura.
3. Incubar oócitos a 18 ° C para os pontos de tempo que varia entre 8 e 48 horas.

Parte 5: Fixação Desidratação e Armazenamento de Oócitos

1. Resolver quaisquer oócitos mortos e coloque oócitos sobreviventes em frascos de vidro. Forma rotineira,> de sobrevivência de 90%.
2. Oócitos lugar em MEMFA fixadora (ver Materiais e Métodos) e rock por 20 minutos. Proteger os oócitos da luz, cobrindo com papel alumínio.
3. Lavar oócitos, removendo e substituindo fixador com volume igual de tampão MBSH. Repita este lave uma vez mais, num total de duas lavagens.
4. Lavar oócitos em metanol anidro:
   1. Retire metade do volume, substitua com metanol.
   2. Repita o passo "a" duas vezes.
   3. Retire toda a solução, substitua com metanol.
   4. Repita lavar metanol.
5. Oócitos podem ser armazenadas a -20 ° C até que esteja pronto para a imagem.

Parte 6: Imagem de localização RNA por microscopia confocal

1. Antes de imagem, adicionar Médio Murray s Clearing (2:1 álcool benzílico benzoato-benzil) para um fundo de vidro FluoroDish (WPI Inc.) para cobrir a superfície de imagem.
2. Transferir cuidadosamente os oócitos do metanol para a FluoroDish, minimizando o volume de metanol transferidos.
3. Imagem em um microscópio invertido confocal (Nós temos utilizado com sucesso um LSM510 Zeiss e uma Leica TCS SP2).

Figura 1:.. Visualização de Localização RNA Subcelulares pela microinjeção de Transcrições fluorescente etiquetado A. Após a microinjeção, RNA marcado com Alexa Fluor 546 é inicialmente restrita ao núcleo B. Depois de oito horas de cultura, uma RNA fluorescente etiquetado controle pode ser visto de maneira uniforme distribuídos no citoplasma do ovócito. C. No entanto, RNA fluorescente etiquetado contendo seqüências que recrutam as máquinas de transporte pode ser visto no processo de localização subcelular ao pólo vegetal do oócito (para baixo). Barra de escala = 50 mm.

Discussion

Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função in vivo. Além disso, usando adicionais Alexa-UTP fluoróforos, várias espécies de RNA pode ser visualizado no ovócito mesmo. Descobrimos que em oócitos Xenopus Alexa Fluor 546-14-UTP dá resultados superiores em comparação com Alexa Fluor 488-5-UTP por causa da autofluorescência na faixa de comprimento de onda 488 nm, no entanto, imaging dupla de dois RNAs não deixa de ser possível (Gagnon e Mowry, 2009). Além disso, esta técnica funciona bem em conjunto com protocolos imunocoloração para detectar co-localização de proteínas, como uma grande variedade de anticorpos secundários compatíveis fluorescentes estão disponíveis (Yoon e Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Finalmente, a interrupção do processo de localização através de RNA sobre-expressão de fatores negativos dominantes ou interferência pequena molécula pode ser combinado com este ensaio para visualizar defeitos sutis no caminho de localização mRNA (Messitt et al., 2008). Esta técnica tem provado ser um ensaio relativamente simples e robusto para a detecção de distribuição de mRNA in vivo e pode ser integrado facilmente em vigor bioquímica, molecular e celular técnicas biológicas para sondar os mecanismos de transporte de mRNA.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.