Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

Summary

La visualización de

Abstract

Localización del ARN es un mecanismo conservado del establecimiento de la polaridad celular. Vg1 ARNm se localiza en el polo vegetal de ovocitos de Xenopus laevis y actúa para restringir el espacio de expresión génica de la proteína Vg1. El control estricto de Vg1 distribución de esta forma es necesaria para la especificación adecuada capa germinal en el embrión en desarrollo. Elementos de la secuencia de ARN en el 3 'UTR del ARNm, el elemento de localización Vg1 (VLE) son necesarios y suficientes para el transporte directo. Para estudiar el reconocimiento y el transporte de Vg1 ARNm in vivo, hemos desarrollado una técnica que permite un amplio análisis de trans-factor de los mecanismos de transporte dirigido a través de una lectura visual simple.

Para visualizar la localización del ARN, que sintetiza la etiqueta fluorescente del ARN VLE y microinject esta transcripción en oocitos individual. Después del cultivo de ovocitos para permitir el transporte del ARN se inyecta, los ovocitos son fijos y deshidratado antes de la imagen por microscopía confocal. Visualización de patrones de localización del ARNm proporciona una lectura para el control de la vía completa de ARN de transporte y para la identificación de los roles en la dirección de ARN de transporte para el cis-elementos que actúan en la transcripción y factores de trans-acción que se unen a los VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Hemos ampliado esta técnica a través de co-localización con ARN y las proteínas adicionales (Gagnon y Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), y en combinación con la interrupción de las proteínas motoras y el citoesqueleto (Messitt et al., 2008) de la sonda de mecanismos que subyacen a la localización del ARNm.

Protocol

Parte 1: La transcripción de ARNm marcado con fluorescencia.

1. Linealizar el plásmido de ADN que contiene el elemento de localización del ARN o la secuencia pertinente y resuspender en 1 mg / l con DEPC tratados con H ₂ O. La plantilla de ADN debe tener sitios aguas arriba promotor de la transcripción T7, SP6, T3 o ARN polimerasa.
2. Añadir los siguientes reactivos a un tubo de 1,5 ml estéril:

   a. 10X buffer Tx (ver M & M)	2 l
   b. 20X tapa / mezcla de NTP (ver M & M)	1 l
   c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen)	1 l
   d. UTP, [α-32P] (1 Ci / l) (Perkin Elmer)	1 l
   e. DEPC-H 2 O	11 l
   f. 0,2 M TDT	1 l
   g. RNasin (Promega)	1 l
   h. la plantilla de ADN lineal	1 l
   i. ARN polimerasa (Promega)	1 l

3. Mezclar los reactivos con cuidado y centrifugar brevemente (10 seg. En una microcentrífuga).
4. Incubar durante 2-4 horas a 37 ° C, que cubre el tubo con papel de aluminio para evitar que photobleaching de fluoróforo.
5. Añadir 1 l de 1 mg / ml RNasa libre de DNasa (Promega) que degradan el ADN de la plantilla.
6. Incubar 15 minutos a 37 ° C.
7. Agregar 79 l 20 mM EDTA (pH 8,0) para detener la reacción.
8. Quitar un l a un tubo por separado, etiquetados como "entrada" y guardar.
9. Girar la reacción a través de una columna de 1 ml G50 (ver Materiales y Métodos), que incluye los nucleótidos no incorporados, excluyendo de ARNm de larga duración.
10. Concentrar el ARN mediante precipitación con etanol:
    1. Añadir 250 l de etanol 100%, 10 l 7 millones de CH ₃ COONH _4, 1 l transporte del ARN (tRNA de levadura, 10 g / l) o una de glucógeno l (20 mg / ml).
    2. Mezclar bien y congelar hasta que esté sólido a -80 ° C durante> 30 minutos o en hielo seco durante 15 minutos.
    3. Vuelta a la máxima velocidad en microcentrífuga durante 15 minutos, el sobrenadante se decanta.
    4. Lavar con 150 ml de etanol al 75%.
    5. Girar durante 3 minutos a máxima velocidad en microcentrífuga, se decanta el sobrenadante.
    6. Secar el pellet a 37 ° C durante 3 minutos, asegurándose de que todo el etanol se ha evaporado.
11. Resuspender en 11 l DEPC-H ₂ O y eliminar un l a un tubo por separado, etiquetados como "incorporados".
12. Determinar la incorporación por ciento y se diluye el ARN de 50 nm (ver Materiales y Métodos para el cálculo).
13. El ARN se deben congelar en alícuotas de 5 l, para un solo uso para evitar la congelación / descongelación ciclos y se puede almacenar durante varias semanas a -80 ° C.

Parte 2: Preparación para la microinyección.

1. ARN de preparación:
   Descongelar una alícuota de ARN (50 nM), y desnaturalizar el ARN a 70 ° C durante 3-5 minutos. Girar durante 10 minutos en microcentrífuga a temperatura ambiente a la máxima velocidad para eliminar cualquier partícula, y mantener en hielo.
2. Ovocito de preparación:
   1. Extraer quirúrgicamente del ovario de Xenopus laevis mujeres (Nasco).
   2. Piezas especiales de Xenopus laevis ovario en un tubo cónico de 50 ml que contienen 25 ml de solución de colagenasa (ver Materiales y Métodos).
   3. Agitar suavemente a 18 ° C durante 15 minutos, o hasta que los ovocitos son visiblemente separados del ovario. Debido a la variación entre lotes, el tiempo de la colagenasa tratamiento puede variar y deben ser vigilados cuidadosamente a través de inspección visual para defoliculation.
   4. Permita que los ovocitos que se establecen en el tubo, retirar la solución y lavar los ovocitos con tampón MBSH (ver Materiales y Métodos).
   5. Repetir el lavado dos veces más para un total de tres lavados. Este protocolo de aislamiento de los ovocitos es similar a la que se detalla en Cohen et al., 2009.
   6. Manual tipo estadio III / IV ovocitos (Dumont, 1972) en tampón MBSH bajo un microscopio de disección estándar. Etapa III ovocitos son completamente opacos, pero de color blanco, mientras que la etapa IV ovocitos son ligeramente más grandes y pintados con un pigmento. Los ovocitos que son un poco transparentes son demasiado jóvenes y que los ovocitos completamente pigmentados o distribución presentan pigmento polarizados son demasiado viejos.
3. Aguja de preparación:
   Pull and agujas de bisel a un diámetro exterior de ~ 0,05 mm. (Usamos Drummond Científico de 3,5 pulgadas capilares (para n º 3-000-203-G / X), un Sutter Instrument Co. micropipeta extractor y una biseladora WPI Inc.).

Parte 3: Microinyección

1. Calibrar la aguja con DEPC-H ₂ O 2 para entregar nl por inyección. Estamos frente a la carga con una aguja de nuestra microinyector impulsadas por gas (ver Materiales y Métodos), y calibrar el tamaño de gota con un micrómetro.
2. La carga de ARN utilizando una aguja.
3. Lugar ordenados ovocitos en un plato de inyección que contiene tampón MBSH. Nos microinject en un plato con una capa de espuma de caucho negro. Los ovocitos pálido destacan también en un blanco background.
4. Con cuidado, se inyectan cada ovocito con 2 nl de ARN de 50 nm.
5. Expulsar a ARN, enjuague la aguja con DEPC-H ₂ O, y carga de ARN para la inyección siguiente.

Parte 4: Cultura de ovocitos

1. Ovocitos a cabo en un pocillo de una placa estéril 24 y (Sigma Aldrich). Nos cultura hasta un millar de ovocitos por pocillo.
2. Quitar búfer y reemplazar con 400 l O ocyte C ultura edium M (OCM; ver Materiales y Métodos) por pocillo. Coloque la placa de la cultura dentro de un recipiente de plástico hermético con una toalla de papel húmeda para mantener el ambiente húmedo durante el cultivo.
3. Incubar los ovocitos a 18 ° C para los puntos de tiempo que oscila entre 8 y 48 horas.

Parte 5: fijación, deshidratación y almacenamiento de ovocitos

1. Resolver cualquier ovocitos muertos y el lugar ovocitos supervivientes en frascos de vidrio. En forma rutinaria observar la supervivencia> 90%.
2. Ovocitos lugar en MEMFA fijación (véase Materiales y Métodos) y el rock durante 20 minutos. Proteger a los ovocitos de la luz cubriendo con papel de aluminio.
3. Lavado de los ovocitos mediante la eliminación de fijador y su sustitución con un volumen igual de tampón de MBSH. Repetir este lavado una vez más para un total de dos lavados.
4. Lavado de los ovocitos en metanol anhidro:
   1. Eliminar la mitad del volumen, reemplazar con metanol.
   2. Repita el paso "a" dos veces.
   3. Eliminar toda la solución, reemplace con metanol.
   4. Repetir el lavado de metanol.
5. Los ovocitos se pueden almacenar a -20 ° C hasta el momento de la imagen.

Parte 6: Imagen de localización del ARN por microscopía confocal

1. Antes de imágenes, añadir media Murray s de Compensación (2:1 benzoato de bencilo, alcohol bencílico) a un FluoroDish con fondo de cristal (WPI Inc.) para cubrir la superficie de la imagen.
2. Con cuidado, la transferencia de los óvulos a partir de metanol para FluoroDish, minimizando el volumen de metanol transferidos.
3. La imagen en un microscopio confocal invertido (Hemos utilizado con éxito un LSM510 Zeiss y una Leica TCS SP2).

Figura 1:.. Visualización de la localización subcelular de ARN mediante la microinyección de transcripciones Fluorescente etiquetados microinyección A. A continuación, el ARN marcado con Alexa Fluor 546 es un principio restringido al núcleo B. Después de ocho horas de la cultura, una etiqueta fluorescente del ARN de control puede ser visto de manera uniforme distribuidos en el citoplasma del ovocito. C. Sin embargo, el ARN marcado con fluorescencia que contiene secuencias que reclutar a la maquinaria de transporte se puede ver en el proceso de localización subcelular al polo vegetal del oocito (hacia abajo). Barra de escala = 50 micras.

Discussion

Aquí hemos presentado un protocolo para visualizar la localización del mRNA en ovocitos de Xenopus. Este método, usando la etiqueta fluorescente transcripciones de ARN tiene una mayor relación señal-ruido de lo que se obtiene con la marcada con digoxigenina transcripciones y es más sencillo y más rápido de lo in-situ los enfoques basados ​​en (Mowry y Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos diseñar ARN secuencia de mutaciones y rápida prueba para la función in vivo. Además, mediante el uso adicional de Alexa-UTP fluoróforos, varias especies de ARN se puede visualizar en el ovocito mismo. Hemos encontrado que en ovocitos de Xenopus Alexa Fluor 546-14-UTP ofrece resultados superiores en comparación con Alexa Fluor 488-5-UTP porque la autofluorescencia en el rango de 488 nm de longitud de onda, sin embargo, la imagen dual de dos RNAs obstante, es posible (Gagnon y Mowry, 2009). Además, esta técnica funciona bien en conjunto con los protocolos de tinción para detectar la colocalización de proteínas, como una gran variedad de compatible anticuerpos secundarios fluorescentes están disponibles (Yoon y Mowry, 2006, Messitt et al., 2008). Por último, la interrupción del proceso de localización del ARN a través de la sobre-expresión de los factores negativos dominante o la interferencia de pequeñas moléculas se pueden combinar con este ensayo para visualizar los defectos sutiles en la vía de la localización del mRNA (Messitt et al., 2008). Esta técnica ha demostrado ser una prueba relativamente simple y robusto para la detección de mRNA de la distribución in vivo y se puede integrar fácilmente en los actuales técnicas bioquímicas, de biología molecular y celular para probar los mecanismos de transporte del ARNm.

Materials

10X Tx buffer

60 mM MgCl2 400 mM Tris-HCl (pH 7.5) 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

10 mM CTP 10 mM ATP 9 mM UTP 2 mM GTP 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H2O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions: 0.5 ml 0.2 M EDTA 1 ml 1 M Tris pH 8.0 0.5 ml 20% SDS Store complete G-50 solution at 4 ° C. Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny). Swirl complete G-50 solution to resuspend beads. Add 2 ml G-50 solution to the empty column. Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge. Add 200 μl DEPC-treated deionized H2O to each column. Spin. Repeat wash twice more for a total of three washes. Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 25 ml 0.1 M KPO3+ (pH 7.4)

MBSH buffer

88 mM NaCl 1 mM KCl 2.4 mM NaHCO3 0.82 mM MgSO4 X 7H2O 0.33 mM Ca(NO3)2 X 4H2O 0.41 mM CaCl2 X 6H2O 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

50% L15 medium 15 mM HEPES (pH 7.6) 1 mg/ml insulin 100 mg/ml gentamicin 50 U/ml nystatin 50 U/ml penicillin 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

Determine CPM in "input" and "incorporated" samples using a standard scintillation counter. incorporation = ("incorporated") / (10 x "input") Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10. Maximum theoretical yields for different polymerases: T7, T3, SP6 - 2.64 μg Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation) Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10-8) The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.