Summary
Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.
Abstract
Histologia óssea Undecalcified demonstra a micro-arquitetura do osso. Ele mostra tanto os componentes mineralizados e celulares do osso, que fornece informações vitais sobre o turnover ósseo ou formação e reabsorção óssea. Isto tem uma enorme importância em uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. Ele produz belas imagens 1 e permite técnicas como a avaliação fluorocromo e histomorfometria 2. Análise fluorocromo é uma técnica onde corantes fluorescentes que se ligam ao cálcio são injetados em um ponto determinado momento, que permite a quantificação da quantidade de mineralização naquele momento. Histomorfometria é um processo de quantificação do osso ao nível microscópico.
Realizar histologia óssea undecalcified é tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Ela exige variações na técnica dos utilizados em parafina padrão incorporado histologia. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los. Preparação de amostras de fixação e processamento são alcançados com uma forma semelhante a outros tecidos moles, no entanto, devido à densidade e menor permeabilidade do osso consideravelmente maior fixação e os tempos de processamento são necessárias, muitas vezes levando várias semanas. Incorporação é alcançado usando um meio de suporte com dureza semelhantes ou iguais e densidade do osso, como metacrilato de resinas à base, mas ao contrário de infiltração de parafina e incorporação, este é um passo irreversível. Seccionamento pode ser conseguido através de moagem, que produz uma espessa seção, que é ótimo para os estudos, como a análise fluorocromo. Este é o melhor conseguido usando uma lâmina de diamante em uma macrotome. Alternativamente, as seções mais finas podem ser produzidas por microscopia de luz e isso é conseguido usando um micrótomo trenó com uma lâmina muito afiada. O micrótomo sledge fornece a maior resistência e estabilidade necessária para grandes blocos rígidos. Seções de resina incorporado pode ser manchado com uma variedade de manchas, que são demonstradas.
Protocol
- O tecido é colocado em um recipiente selado contendo fosfato tamponado a 10% solução de formalina 3. Garantir que a exposição mínima à luz, se a análise fluorocromo é para ser realizado, como a fluorocromos são sensíveis à luz.
- Estabelecer qual a orientação do tecido serão necessários.
- Apare a amostra com o tamanho, na orientação correta, usando uma serra de fita. Medidas de garantir a segurança são cumpridas. A amostra é então colocada em um recipiente opaco, cujo volume deve ser de aproximadamente dez vezes o tamanho da amostra para obter uma fixação adequada. O espécime deve permanecer na solução de formalina um total de entre uma e duas semanas dependendo do seu tamanho. Sugere-se o uso de tecidos de controle para fins de teste e otimização.
- Verifique o tecido se encaixa no molde de incorporação e coloque o tecido em um recipiente selado opaco contendo etanol 70%.
- Processo o tecido em ordem crescente as concentrações de etanol, protegendo da luz e sob agitação constante.
- 70% de etanol 1 semana
- 80% de etanol 1 semana
- 90% de etanol 1 semana
- 100% de etanol 1 semana
- O tecido é então apagado em butanol para uma semana, mais uma vez blindagem da luz e sob agitação constante.
- A densidade da resina e osso devem ser cuidadosamente acompanhado. A densidade da resina pode ser alterada (ver passo 8) e recomendamos a incorporação de um espécime primeiro teste para garantir a densidade correta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopia de luz e análise fluorocromo. Se imunohistoquímica é necessária uma resina alternativa deve ser usada como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
- A solução de preparação Technovit 7100 pode ser misturado com pequenas alíquotas da solução de amolecimento fornecido com o kit, se necessário, mas não mais que 5% o volume de solução de preparação, em nossa experiência, a solução de amolecimento raramente é necessário. Partes iguais de etanol absoluto e Technovit base líquida 7100 são misturados e aplicados ao tecido como uma solução de infiltração de pré-por 24 horas minimizando a exposição à luz e com agitação.
- A solução é, então, a infiltração composto usando um endurecedor g I (= saco 1) que é dissolvido em 100 ml de líquido de base. Isto substitui a solução de pré-infiltração e é permitido para se infiltrar em uma semana sob agitação constante.
- Coloque o tecido no molde, com o rosto superfície de corte para baixo. Garantir que há uma margem (de preferência, pelo menos, 5 milímetros) em todo o tecido para a resina, o que garante força bloco. Mix 15mls de Technovit solução de preparação 7100 com 1 ml de endurecedor II e despeje em torno de amostra no molde e cobri-lo em pelo menos 5 millimietres. Cura vai começar dentro de 2 horas, mas será concluída durante a noite.
- Montagem é, então, realizada por formar um bloco de apoio usando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 em uma relação de volume de 2 partes de pó para 1 parte de líquido para obter um líquido viscoso. Despeje Technovit 3040 no recesso na parte de trás do bloco a um nível de pelo menos 2 mm acima da base do bloco. Após cerca de 10 minutos, o molde pode ser desfeito, eo bloco está pronto.
- A densidade e, portanto, as propriedades de corte de resina de metacrilato são suscetíveis à umidade ambiente na sala. Os blocos devem ser armazenados em um dessecador.
- Seccionamento terra produz seções maiores entre 20-50 micrômetros de espessura. É útil para a análise fluorocromo (ver secção abaixo) como seções mais espessas produzem mais brilhante fluorescência. Fixe o disco de diamante para macrotome. Adicionar lubrificante, como o espírito de petróleo para o reservatório no macrotome. Garantir o bloco no grampo e orientar a lâmina. Permitem moer a ocorrer lentamente (cerca de 20-30 minutos por seção) garantindo a lubrificação adequada. A primeira seção expõe a face de corte e orienta a seção deve ser descartado.
- A próxima seção é então colocada sobre uma lâmina Além disso Superfrost. A seção tem uma tendência a enrolar por isso, recomendamos colocar uma porção de um saco de sanduíche por cima e, em seguida, segurando-o apartamento com outro slide preso no lugar. É então colocado em uma incubadora de entre 60-80 graus Celsius durante 1 hora. Isto suaviza a metacrilato e ajuda a seção aderir ao deslize de uma forma plana.
- A seção de solo pode ser limpo e polido, conforme necessário usando lixa fina de uma maneira suave.
- O micrótomo sledge cortes cortes finos, que proporciona o melhor seções para microsocopy luz. Use um micrótomo trenó como tem adicionado rigidez, que é necessário para o corte desses blocos rígidos. Alternativamente um micrótomo rotativo movido podem ser usados. Use uma lâmina de aço inoxidável afiada. É preferível ter duas lâminas disponíveis como se pode ser afiada como a outra é utilizada. A lâmina deve fazer um ângulo de 45 graus com o bloco. Suamolecimento rface pode ser conseguido pela aplicação de um papel molhado para o bloco, se necessário. Pode levar várias seções para atingir as condições de corte desejado para obter uma seção de qualidade. A seção é então flutuou em um banho de água e colocado sobre uma lâmina como em 16, supra.
- Reagentes de coloração estão listados em Materiais abaixo. Protocolos são baseados em quatro Bancroft et al. Devido à variação de espessura é recomendado para otimizar manchas em lâminas. Rack de coloração dos tecidos pode provocar a flutuar fora do slide para adicionar a manchas diretamente para um slide plana pode ser necessária. Um protocolo idêntico ou coloração rack é necessário para resultados consistentes coloração exigida para histomorfometria.
- Hematoxilina e eosina
- Mancha com Haematoxyilin 5-10 minutos
- Lave bem com água da torneira Scott s
- Mancha com Eosina 5 minutos
- Lavar em água corrente
- Limpar em xilol
- Montar
- Resultados
- Osteóide = rosa
- Óssea calcificada = marrom arroxeada
- Núcleos = blue
- Von Kossa
- Lugar em solução de nitrato de prata e expor à luz forte até o osso fica preto (aprox. 10 min)
- Lavar em água destilada por três vezes
- Ameaça com tiossulfato de sódio por 5 minutos
- Lavar em água destilada
- Contracoloração com Safrinin O
- Limpar em xilol
- Montar
- Resultados
- Óssea Mineralised = preto
- Osteóide = vermelho / rosa
- Masson Goldner s Trichrome
- Lavar com álcool alcalina (90mls de etanol 80% e 10mls de amônia 25% para 20 minutos)
- Enxaguar em água
- Enxágüe em água destilada
- Mancha com Hematoxilina Weigert s por 10 minutos
- Enxágüe em água destilada
- Mancha com Ponceau-Fucsina solução final 5 minutos
- Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo
- Mancha em fosfomolíbdico ácido-laranja solução G 5 minutos
- Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo
- Mancha com luz verde 5 minutos
- Enxágüe com 1% de ácido acético 3 mudanças
- Enxágüe em água destilada
- Montar
- Resultados
- Óssea Mineralised = verde
- Osteóide = vermelho / laranja
- Núcleos = azul cinza
- Cartilagem = roxo
- Hematoxilina e eosina
- Preparações fluorocromo:
- Estes são administrados por injecção intravenosa lenta, pelo menos duas semanas de intervalo.
- Doses
- Calceína Verde 10 mg / kg IV
- Oxitetraciclina 50 mg / kg IV
- Alizarina complexona 30 mg / kg IV
- Preparação de calceína Verde
- Um grama de calceína Verde é titulado com NaOH 1 M até dissolver.
- pH é ajustado com NaOH 1% até pH = 7,1-7,2.
- Filtro e manter protegido da luz
- Preparação de Alizarina complexona
- Três gramas de Alizarina complexona é titulado com NaOH 1 M até dissolver.
- pH é ajustado com HCl 1% ou NaOH até pH = 7,1-7,2.
- Filtro e manter protegido da luz
- Preparação de Oxitetraciclina
- Oxitetraciclina está disponível como um fora da prateleira de drogas anti-microbial. Não requer preparação.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio da Sra. Sue Connell por sua especialização na incorporação de resina e Túmulos Ms Stephania para sua perícia em laboratório. Os autores gostariam de agradecer ao professor Frank Kandziora e Dr. Marie-Anne Polboth para os seus conselhos.
References
- Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
- An, Y. H., Martin, K. l Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).
- Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).