Undecalcified Bone Förberedelse för histologi, Histomorphometry och fluorokrom Analys

Summary

Undecalcified ben histologi innehåller viktig information för en rad olika kliniska och forskningsansökningar. Det är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem.

Abstract

Undecalcified ben histologi visar mikro-arkitektur ben. Det visar både den mineraliserade och cellulära komponenter av ben, som ger viktig information på benomsättning eller benbildning och benresorption. Detta har enorm betydelse i olika kliniska och forskningsansökningar. Det ger vackra bilder ¹ och tillåter tekniker såsom fluorokrom bedömning och histomorphometry ^2. Fluorokrom analys är en teknik där fluorescerande färger som binder till kalcium injiceras vid en viss tidpunkt, vilket möjliggör kvantifiering av mängden mineraliseringen vid denna tid. Histomorphometry är en process av ben kvantifiering på mikroskopisk nivå.

Utföra undecalcified ben histologi är tekniskt utmanande, särskilt med stora exemplar. Det kräver variationer i tekniken från dem som används i standard paraffininbäddad histologi. Denna video visar hur processen för att producera bra kvalitet sektioner och visar på tekniska svårigheter och metoder som man kan övervinna dem. Provberedning, fixering och bearbetning uppnås med ett liknande sätt som andra mjuka vävnader, men på grund av densitet och lägre permeabilitet av ben betydligt längre fixering och handläggningstider krävs ofta tar flera veckor. Inbäddning sker med hjälp av en stödjande medium med liknande eller samma hårdhet och täthet till benet som metakrylatbaserade hartser, men till skillnad från paraffin infiltration och bädda, detta är ett oåterkalleligt steg. Sektionering kan uppnås genom slipning som ger en tjockare del, som är optimal för studier som fluorokrom analys. Detta uppnås bäst med hjälp av en diamantklinga på en macrotome. Alternativt kan tunnare tas fram för ljusmikroskopi och detta uppnås med hjälp av en släde mikrotom med en mycket vass kniv. Släden mikrotom ger ytterligare styrka och stabilitet som krävs för stora, hårda block. Resin inbäddade sektioner kan färgas med olika fläckar, som demonstreras.

Protocol

1. Vävnaden placeras i en sluten behållare som innehåller 10% fosfatbuffrad formalin lösning ^3. Säkerställa minimal exponering för ljus, om fluorokrom analys skall utföras, eftersom fluorokromer är ljuskänsliga.
2. Fastställa vilka orientering av vävnad kommer att krävas.
3. Trimma provet storlek, i rätt riktning, med hjälp av en bandsåg. Se till att säkerhetsåtgärder följs. Provet sedan placeras i en genomskinlig behållare, bör vars volym vara cirka tio gånger storleken av provet för att uppnå adekvat fixering. Provet bör vara kvar i formalin lösning totalt mellan en och två veckor beroende på dess storlek. Det föreslås att använda kontroll vävnad för testning och optimering.
4. Kontrollera vävnaden passar in i inbäddning formen och placera vävnaden i en ogenomskinliga behållare som innehåller 70% etanol.
5. Process vävnaden i stigande koncentrationer av etanol, avskärmning mot ljus och under konstant omrörning.
   1. 70% etanol 1 vecka
   2. 80% etanol 1 vecka
   3. 90% etanol 1 vecka
   4. 100% etanol 1 vecka
6. Vävnaden är då godkännas i butanol under 1 vecka, återigen skyddar mot ljus och under konstant omrörning.
7. Tätheten av kåda och ben bör noggrant matchas. Hartsen densitet kan ändras (se steg 8) och vi rekommenderar att bädda in en provbit först säkerställa korrekt densitet. Vi använder Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) för ljusmikroskopi och fluorokrom analys. Om immunohistokemi behövs ett alternativ harts måste användas som Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. Den Technovit 7100 preparatet lösning kan blandas med små portioner av mjukgörande lösningen som följer med kitet, om det behövs, men inte mer än 5% av volymen av preparatet lösning, enligt vår erfarenhet de mjukgörande lösningen är sällan krävs. Lika delar av absolut etanol och bas flytande Technovit 7100 blandas och appliceras på vävnaderna som en pre-infiltration lösning i 24 timmar minimera ljus exponering och med agitation.
9. Den infiltration lösningen görs därefter upp med 1 g härdare jag (= 1 påse) som är upplöst i 100 ml bas vätska. Detta ersätter före infiltration lösning och tillåts att infiltrera i 1 vecka under konstant omrörning.
10. Placera vävnaden i formen, med skära ytan nedåt. Se till att det finns en marginal (helst minst 5 millimeter) runt vävnad för harts, vilket gör blocket styrka. Blanda 15mls av Technovit 7100 förberedelser lösningen med 1 ml härdare II och häll runt exemplar i formen och täck den med minst 5 millimietres. Härdning kommer att påbörjas inom 2 timmar, men kommer att bli klar över en natt.
11. Montering utförs sedan genom att forma ett underlag blocket med Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Blanda Technovit 3040 i en volym förhållandet 2 delar pulver med 1 del vätska för att få en trögflytande vätska. Häll Technovit 3040 i fördjupningen på baksidan av blocket till en nivå på minst 2 mm ovanför botten av blocket. Efter ca 10 minuter formen kan skäras bort och blocket är klart.
12. Densiteten och därmed skära egenskaper methacrylate harts är känsliga för den omgivande luftfuktigheten i rummet. Blocken bör därför förvaras i exsickator.
13. Ground sektionering ger större sektioner mellan 20-50 mikrometer i tjocklek. Det är användbart för fluorokrom analys (se avsnitt nedan) som tjockare sektioner ger ljusare fluorescens. Säkra diamantklinga till macrotome. Lägg smörjmedel, såsom olja ande till reservoaren på macrotome. Säkra block i klämma och orientera till blad. Låt slipning ske långsamt (ca 20-30 minuter per avsnitt) säkerställa tillräcklig smörjning. Det första avsnittet exponerar skära ansiktet och orienterar avsnittet-det skall kasseras.
14. I nästa avsnitt är sedan placeras på en SuperFrost Plus bild. Avsnittet har en tendens att krypa så vi rekommenderar att placera en del av en plastpåse över den och sedan hålla den platt med en annan bild spänns på plats. Det är sedan placeras i en kuvös på mellan 60-80 grader i 1 timme. Detta mjukar upp metakrylat och hjälper avsnittet följer bilden på ett platt sätt.
15. Marken avsnittet kan rengöras och poleras enligt önskemål med fint sandpapper på ett skonsamt sätt.
16. Släden mikrotom skär tunna sektioner, som ger den bästa avsnitten för lätta microsocopy. Använd en släde mikrotom som det har lagt rigiditet, som krävs för att skära dessa hårda block. Alternativt en driven roterande mikrotom kan användas. Använd en vass blad i rostfritt stål. Det är bättre att ha två knivar finns som man kan slipas när den andra används. Bladet bör göra en 45 graders vinkel med blocket. Surface mjukgörande kan uppnås genom att tillämpa ett blött papper till blocket om det behövs. Det kan ta flera sektioner för att uppnå önskad skärdata för att få en kvalitet avsnitt. Avsnittet därefter flöt på ett vattenbad och placeras i en bild som i 16 ovan.
17. Färgreagenser listas i material nedan. Protokollen baseras på Bancroft ⁴ et al. På grund av tjockleken variation är det rekommenderat att optimera fläckar på testglasen. Rack färgning kan orsaka vävnaden att flyta från bilden så att lägga till fläckar direkt till en platt bild kan krävas. En identisk protokoll eller rack färgning är nödvändig för en konsekvent färgning utfall krävs för histomorphometry.
    1. Hematoxylin och eosin
       1. Fläcken med Haematoxyilin 5-10 minuter
       2. Tvätta väl med Scott s kranvatten
       3. Fläcken med Eosin 5 minuter
       4. Tvätta i kranvatten
       5. Klart i xylen
       6. Mount
       7. Resultat
          1. Osteoid = rosa
          2. Förkalkade ben = lila brun
          3. Nuclei = blå
    2. Von Kossa
       1. Placera i silvernitratlösning och utsättas för starkt ljus tills mineraliserat ben blir svart (ca 10 min)
       2. Tvätta i destillerat vatten tre gånger
       3. Hot med Natriumtiosulfat i 5 minuter
       4. Tvätta i destillerat vatten
       5. Motfärga med Safrinin O
       6. Klart i xylen
       7. Mount
       8. Resultat
          1. Mineraliserade ben = svart
          2. Osteoid = röd / rosa
    3. Masson Goldner s trikrom
       1. Tvätta med alkaliskt alkohol (90mls av 80% etanol och 10mls 25% ammoniak under 20 minuter)
       2. Skölj i vatten
       3. Skölj i destillerat vatten
       4. Fläcken med Weigert s haematoxylin i 10 minuter
       5. Skölj i destillerat vatten
       6. Fläcken med Ponceau-Fuchsin slutgiltiga lösningen 5 minuter
       7. Skölj med 1% ättiksyra 15 sekunder
       8. Fläck i fosformolybdensyra-orange g lösning 5 minuter
       9. Skölj med 1% ättiksyra 15 sekunder
       10. Fläcken med ljusgrön 5 minuter
       11. Skölj med 1% ättiksyra 3 förändringar
       12. Skölj i destillerat vatten
       13. Mount
       14. Resultat
           1. Mineraliserade ben = grön
           2. Osteoid = röd / orange
           3. Nuclei = blå grå
           4. Brosk = lila
18. Fluorokrom förberedelser:
19. Dessa administreras genom långsam intravenös injektion, minst två veckors mellanrum.
20. Doser
    1. Kalcein Grön 10 mg / kg IV
    2. Oxytetracyklin 50 mg / kg IV
    3. Alizarin Complexone 30 mg / kg IV
21. Beredning av kalcein Grön
    1. Ett gram av kalcein Grön titreras med 1 M NaOH tills det är upplöst.
    2. pH justeras med 1% NaOH tills pH = 7,1-7,2.
    3. Filter och hålla avskärmade från ljuset
22. Beredning av Alizarin Complexone
    1. Tre gram Alizarin complexone titreras med 1 M NaOH tills det är upplöst.
    2. pH-justeras sedan med 1% HCl eller NaOH tills pH = 7,1-7,2.
    3. Filter och hålla avskärmade från ljuset
23. Beredning av Oxytetracyklin
    1. Oxytetracyklin finns som en från hyllan antimikrobiell. Ingen förberedelse krävs.