Biology

Undecalcified Bone Voorbereiding voor Histologie, histomorfometrie en fluorchroom Analyse

Published: January 8, 2010 doi: 10.3791/1707

Tony Goldschlager¹, Amany Abdelkader¹, Jeffrey Kerr², Ian Boundy², Graham Jenkin¹

¹Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, ²Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Undecalcified bot histologie levert belangrijke informatie voor een verscheidenheid aan klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen.

Abstract

Undecalcified bot histologie demonstreert de micro-architectuur van het bot. Het toont zowel de gemineraliseerde en cellulaire componenten van het bot, dat vitale informatie over botmetabolisme of botvorming en botresorptie biedt. Dit heeft een enorme betekenis in een verscheidenheid van klinische en wetenschappelijke toepassingen. Het levert prachtige beelden ¹ en staat voor technieken zoals fluorochroom beoordeling en histomorfometrie ^2. Fluorochroom analyse is een techniek waarbij fluorescerende kleurstoffen die zich binden aan calcium worden geïnjecteerd op een bepaald tijdstip, dat voor het kwantificeren van de hoeveelheid mineralisatie kan op dat gegeven moment. Histomorfometrie is een proces van bot kwantificering op microscopisch niveau.

Het uitvoeren van undecalcified bot histologie is technisch uitdagend, met name bij grote afmetingen exemplaren. Het vereist variaties in de techniek uit die worden gebruikt in standaard paraffine ingebed histologie. Deze video illustreert het proces van het produceren van een goede kwaliteit onderdelen en demonstreert de technische problemen en methoden waarmee ze te overwinnen. Prepareren, fixatie en verwerking worden bereikt met een manier die vergelijkbaar is met andere zachte weefsels, maar door de dichtheid en de lagere permeabiliteit van het bot aanzienlijk langer fixatie en doorlooptijden nodig zijn, vaak het nemen van enkele weken. Inbedding is bereikt met behulp van een ondersteunende medium met soortgelijke of gelijk zijn hardheid en de dichtheid tot op het bot, zoals methacrylaat gebaseerde harsen, maar in tegenstelling tot paraffine infiltratie en inbedding, dit is een onomkeerbare stap. Snijden kan worden bereikt door slijpen die produceert een dikkere deel, dat optimaal is voor studies, zoals fluorchroom analyse. Dit wordt het best bereikt met behulp van een diamant blad op een macrotome. Als alternatief kunnen dunnere gedeelten worden geproduceerd voor lichtmicroscopie en dit is bereikt met behulp van een slede microtoom met een zeer scherp mes. De slee microtoom zorgt voor de extra kracht en stabiliteit die nodig is voor grote, harde blokken. Hars ingebedde coupes kunnen worden gekleurd met een verscheidenheid van vlekken, die zijn aangetoond.

Protocol

Het weefsel wordt geplaatst in een gesloten container met 10% fosfaat gebufferde formaline oplossing ^3. Zorg ervoor dat een minimale blootstelling aan licht, als fluorochroom analyse moet worden uitgevoerd, omdat de fluorochromen zijn lichtgevoelig.
Vast te stellen welke oriëntatie van het weefsel nodig zal zijn.
Trim het monster op maat, in de juiste richting, met behulp van een lintzaag. Zorg ervoor dat veiligheidsmaatregelen in acht worden genomen. Het monster wordt vervolgens geplaatst in een ondoorzichtige container, moet de hoeveelheid die ongeveer tien keer de grootte van het monster om een adequate fixatie te bereiken. Het monster moet blijven in de formaline oplossing een totaal van tussen de een en twee weken, afhankelijk van de grootte ervan. Voorgesteld wordt met behulp van controle weefsel voor het testen en optimalisatie doeleinden.
Controleer het weefsel past in de inbedding vorm en plaats het weefsel in een verzegelde ondoorzichtige container met 70% ethanol.
Proces het weefsel in oplopende concentraties van ethanol, afscherming van licht en onder voortdurend roeren.
1. 70% ethanol 1 week
2. 80% ethanol 1 week
3. 90% ethanol 1 week
4. 100% ethanol 1 week
Het weefsel wordt dan vrijgegeven in butanol voor 1 week, weer afscherming van licht en onder voortdurend roeren.
De dichtheid van de hars en bot moeten nauw worden afgestemd. De hars dichtheid kan worden gewijzigd (zie stap 8) en we raden het inbedden van een proefstuk als eerste de juiste dichtheid te verzekeren. Wij gebruiken Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) voor licht microscopie en fluorchroom analyse. Indien immunohistochemie is nodig een alternatief hars moet worden gebruikt, zoals Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
De Technovit 7100 bereiding oplossing kan worden gemengd met kleine porties van de verzachtende oplossing die bij de kit, indien nodig, maar niet meer dan 5% het volume van de voorbereiding oplossing; in onze ervaring de verzachting oplossing is zelden nodig. Gelijke delen van de absolute ethanol en de basis vloeibare Technovit 7100 worden gemengd en toegepast op het weefsel als een pre-infiltratie-oplossing voor 24 uur het minimaliseren van de blootstelling aan licht en met agitatie.
De infiltratie oplossing wordt dan worden aangevuld met een g harder I (= 1 zak), die wordt opgelost in 100 ml basis van vloeistof. Dit vervangt de pre-infiltratie oplossing en is toegestaan om te infiltreren voor 1 week onder voortdurend roeren.
Leg het weefsel in de mal, met het snijvlak naar beneden. Zorg ervoor dat er een marge (idealiter ten minste 5 millimeter) rond de weefsel voor de hars, dit zorgt voor blok kracht. Mix 15mls van Technovit 7100 voorbereiding oplossing met 1 ml verharder II en giet rond model in de vorm en bedek deze met ten minste 5 millimietres. Uitharding begint binnen 2 uur, maar zal 's nachts worden voltooid.
Montage wordt vervolgens uitgevoerd door fashioning een back-blok met behulp van Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 in een volume verhouding van 2 delen poeder op 1 deel vloeistof naar een stroperige vloeistof te verkrijgen. Giet Technovit 3040 in de uitsparing aan de achterkant van het blok tot een niveau van ten minste 2 mm boven de onderkant van het blok. Na ongeveer 10 minuten de mal kan worden afgepeld en het blok is klaar.
De dichtheid en dus de snij-eigenschappen van methacrylaat hars zijn gevoelig voor de luchtvochtigheid in de kamer. De blokken moeten daarom worden opgeslagen in een exsiccator.
De grond snijden produceert grotere secties tussen 20-50 micrometer dik. Het is nuttig voor fluorochroom-analyse (zie hieronder) als dikkere secties te produceren helderder fluorescentie. Bevestig de diamantschijf te macrotome. Voeg smeermiddel, zoals aardolie geest aan het reservoir op de macrotome. Zet het blok in de klem en oriënteren naar blad. Laat malen langzaam optreden (ongeveer 20-30 minuten per sectie) een adequate smering. Het eerste deel belicht het snijvlak en oriënteert de sectie-het moet worden weggegooid.
In de volgende paragraaf wordt dan geplaatst op een Superfrost Plus dia. De sectie heeft de neiging om te krullen dus we raden het plaatsen van een gedeelte van een boterhamzakje erover en vervolgens vast te houden plat met een andere dia geklemd op zijn plaats. Het is dan geplaatst in een incubator van tussen de 60-80 graden Celsius gedurende 1 uur. Dit verzacht de methacrylaat en helpt de sectie zich te houden aan de dia in een platte manier.
De grond sectie kan worden gereinigd en gepolijst als nodig is met fijn schuurpapier op een zachte manier.
De slee microtoom snijdt dunne secties, die voorziet in de beste delen voor lichte microsocopy. Gebruik een slee microtoom zoals zij heeft toegevoegd stijfheid, die nodig is voor het snijden van deze harde blokken. U kunt ook een aangedreven roterende microtoom kan worden gebruikt. Gebruik een scherp roestvrij stalen mes. Het is beter om twee bladen beschikbaar hebben als een kan worden aangescherpt als de andere wordt gebruikt. Het blad moet een hoek van 45 graden met het blok. Surface verweking kan worden bereikt door het aanbrengen van een nat papier om het blok indien nodig. Het kan enkele onderdelen om de gewenste snijcondities te bereiken een kwaliteit sectie te verkrijgen. De sectie wordt vervolgens dreef op een waterbad en geplaatst op een dia als in 16 hierboven.
Kleurstoffen zijn opgenomen in Materials hieronder. Protocollen zijn gebaseerd op ⁴ Bancroft et al.. Vanwege de dikte van variatie wordt aanbevolen om vlekken te optimaliseren proefglaasjes. Rek vlekken kan veroorzaken weefsel te drijven van de dia toe te voegen, zodat de vlekken direct naar een flat slide kan nodig zijn. Een identieke protocol of rack kleuring is noodzakelijk voor consistente kleuren van de resultaten die nodig zijn voor histomorfometrie.
1. Hematoxyline en eosine
  1. Vlek met Haematoxyilin 5-10 minuten
  2. Goed te wassen met leidingwater Scott s water
  3. Vlek met Eosine 5 minuten
  4. Was in het leidingwater
  5. Duidelijk in xyleen
  6. Monteren
  7. Resultaten
    1. Osteoid = roze
    2. Verkalkte bot = paarsachtig bruin
    3. Kernen = blauw
2. Von Kossa
  1. Plaats in de zilvernitraatoplossing en bloot aan fel licht tot gemineraliseerd bot wordt zwart (ca. 10 minuten)
  2. Was in gedestilleerd water drie keer
  3. Bedreiging met natriumthiosulfaat gedurende 5 minuten
  4. Was in gedistilleerd water
  5. Achtergrondkleuring met Safrinin O
  6. Duidelijk in xyleen
  7. Monteren
  8. Resultaten
    1. Gemineraliseerd bot = zwart
    2. Osteoid = rood / roze
3. Masson Goldner s trichroom
  1. Wassen met alkaline alcohol (90mls van 80% ethanol en 10mls van 25% ammoniak gedurende 20 minuten)
  2. Spoelen in het water
  3. Spoelen in gedistilleerd water
  4. Vlek met Weigert s Haematoxyline gedurende 10 minuten
  5. Spoelen in gedistilleerd water
  6. Vlek met Ponceau-Fuchsin definitieve oplossing 5 minuten
  7. Spoelen met 1% azijnzuur 15 seconden
  8. Vlek in fosfomolybdeenzuur-oranje G-oplossing 5 minuten
  9. Spoelen met 1% azijnzuur 15 seconden
  10. Vlek met licht groen 5 minuten
  11. Spoelen met 1% azijnzuur drie veranderingen
  12. Spoelen in gedistilleerd water
  13. Monteren
  14. Resultaten
    1. Gemineraliseerd bot = groen
    2. Osteoid = rood / oranje
    3. Kernen = blauw grijs
    4. Kraakbeen = paars
Fluorchroom voorbereidingen:
Deze worden beheerd door langzame intraveneuze injectie, ten minste twee weken.
Doses
1. Calceïne Groen 10 mg / kg IV
2. Oxytetracycline 50 mg / kg IV
3. Alizarine Complexon 30 mg / kg IV
Voorbereiding van de Calceïne Green
1. Een gram van calceïne Green wordt getitreerd met 1 M NaOH totdat het is opgelost.
2. pH wordt aangepast met 1% NaOH tot een pH = 7.1-7.2.
3. Filter en houden afgeschermd van het licht
Voorbereiding van de Alizarin Complexon
1. Drie gram van de Alizarin complexon wordt getitreerd met 1 M NaOH totdat het is opgelost.
2. pH-waarde wordt vervolgens aangepast met 1% HCl of NaOH tot pH = 7,1-7,2.
3. Filter en houden afgeschermd van het licht
De voorbereiding van Oxytetracycline
1. Oxytetracycline is beschikbaar als een uit de kast anti-microbiële geneesmiddel. Geen voorbereiding is vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag de hulp van mevrouw Sue Connell erkennen voor haar expertise in hars inbedding en mevrouw Stephania Graven voor haar laboratorium-expertise. De auteurs willen graag professor Frank Kandziora en dr. Marie-Anne Polboth bedanken voor hun advies.

References

Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
An, Y. H., Martin, K. l Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).
Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).