Biology

प्रोटोकॉल, Histomorphometry और Fluorochrome विश्लेषण के लिए Undecalcified अस्थि तैयारी

Published: January 8, 2010 doi: 10.3791/1707

Tony Goldschlager¹, Amany Abdelkader¹, Jeffrey Kerr², Ian Boundy², Graham Jenkin¹

¹Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, ²Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Undecalcified अस्थि ऊतक विज्ञान और नैदानिक अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है. यह तकनीकी रूप से बड़े आकार के नमूनों के साथ विशेष रूप से चुनौती दे रहा है,. यह वीडियो अच्छी गुणवत्ता वर्गों के उत्पादन की प्रक्रिया को दिखाता है और तकनीकी कठिनाइयों और तरीकों के साथ जो उन्हें दूर करने के लिए दर्शाता है.

Abstract

Undecalcified अस्थि ऊतक विज्ञान हड्डी के सूक्ष्म वास्तुकला को दर्शाता है. यह हड्डी, जो हड्डी कारोबार या हड्डी गठन और अवशोषण पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है के दोनों mineralized और सेलुलर घटकों से पता चलता है. यह नैदानिक अनुसंधान और अनुप्रयोगों की एक किस्म में भारी महत्व है. यह सुंदर छवियों पैदावार ¹ और fluorochrome मूल्यांकन और ² histomorphometry जैसे तकनीकों के लिए अनुमति देता है. Fluorochrome विश्लेषण एक तकनीक है, जहां फ्लोरोसेंट रंजक है कि कैल्शियम के लिए बाध्य एक विशेष समय बिंदु है, जो कि दिए गए समय में खनिज की मात्रा की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है पर इंजेक्शन है. Histomorphometry सूक्ष्म स्तर पर हड्डी की मात्रा का ठहराव की एक प्रक्रिया है.

प्रदर्शन undecalcified अस्थि ऊतक विज्ञान तकनीकी रूप से बड़े आकार के नमूनों के साथ विशेष रूप से चुनौती दे रहा है,. यह तकनीक में मानक आयल एम्बेडेड ऊतक विज्ञान में इस्तेमाल उन लोगों से भिन्नरूपों की आवश्यकता है. यह वीडियो अच्छी गुणवत्ता वर्गों के उत्पादन की प्रक्रिया को दिखाता है और तकनीकी कठिनाइयों और तरीकों के साथ जो उन्हें दूर करने के लिए दर्शाता है. नमूना तैयारी निर्धारण, और प्रसंस्करण के एक अन्य मुलायम ऊतकों के लिए समान तरीके से, लेकिन घनत्व और हड्डी के निचले पारगम्यता काफी अब निर्धारण और प्रसंस्करण बार आवश्यक हैं के कारण, अक्सर कई हफ्तों लेने के साथ प्राप्त कर रहे हैं. एम्बेडिंग समान या बराबर कठोरता और methacrylate - आधारित रेजिन जैसे अस्थि घनत्व के समर्थन के साथ एक माध्यम का उपयोग कर हासिल की है, लेकिन आयल घुसपैठ और एम्बेडिंग के विपरीत, यह एक अपरिवर्तनीय कदम है. सेक्शनिंग पीस जो एक मोटा अनुभाग में, जो fluorochrome विश्लेषण के रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए इष्टतम है उत्पादन प्राप्त किया जा सकता है. यह सबसे अच्छा एक macrotome पर एक हीरा ब्लेड का प्रयोग कर प्राप्त है. वैकल्पिक रूप से, पतली वर्गों को प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए उत्पादन किया जा सकता है और यह एक बहुत तेज ब्लेड के साथ एक स्लेज सूक्ष्म तक्षणी का प्रयोग कर प्राप्त है. स्लेज सूक्ष्म तक्षणी बड़े, कठिन ब्लॉकों के लिए आवश्यक अतिरिक्त शक्ति और स्थिरता प्रदान करता है. राल एम्बेडेड वर्गों दाग की एक किस्म है, जो प्रदर्शन कर रहे हैं के साथ दाग जा सकता है.

Protocol

ऊतक के एक मोहरबंद कंटेनर 10% फॉस्फेट युक्त ^{formalin 3} समाधान बफर में रखा है . प्रकाश के लिए न्यूनतम जोखिम सुनिश्चित करें, अगर fluorochrome विश्लेषण प्रदर्शन किया, के रूप में fluorochromes प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं.
स्थापना जो ऊतक के उन्मुखीकरण की आवश्यकता होगी.
आकार करने के लिए नमूना छाँटो, सही ओरिएंटेशन में, एक बैंड का उपयोग कर देखा. सुनिश्चित सुरक्षा उपायों का पालन कर रहे हैं. नमूना तो एक अपारदर्शी कंटेनर में रखा जाता है, जो की मात्रा लगभग दस बार नमूना के आकार करने के लिए पर्याप्त निर्धारण प्राप्त करने चाहिए. नमूना formalin समाधान उसके आकार पर निर्भर करता है के बीच एक और दो सप्ताह के कुल में रहना चाहिए. यह परीक्षण और अनुकूलन के प्रयोजनों के लिए नियंत्रण के ऊतकों का उपयोग करते हुए सुझाव दिया है.
जाँच करें ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड में फिट बैठता है और एक मोहरबंद अपारदर्शी 70% इथेनॉल युक्त कंटेनर में ऊतक जगह.
इथेनॉल की सांद्रता आरोही में ऊतक प्रक्रिया है, प्रकाश से और लगातार आंदोलन के तहत परिरक्षण.
1. 70% इथेनॉल 1 सप्ताह
2. 80% इथेनॉल 1 सप्ताह
3. 90% इथेनॉल 1 सप्ताह
4. 100% इथेनॉल 1 सप्ताह
ऊतक फिर 1 सप्ताह के लिए butanol में मंजूरी दे दी है, फिर से प्रकाश से और लगातार आंदोलन के तहत परिरक्षण.
राल और हड्डी के घनत्व को बारीकी से किया जाना चाहिए. मिलान राल घनत्व (कदम 8 देखें) बदला जा सकता है और हम एक परीक्षण नमूना पहले एम्बेड करने के लिए सही घनत्व सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं. हम प्रकाश माइक्रोस्कोपी और fluorochrome विश्लेषण के लिए 7100 Technovit (Heraeus Kulzer) का उपयोग करें. यदि immunohistochemistry की आवश्यकता है एक वैकल्पिक राल 9100 Technovit (Heraeus Kulzer) के रूप में इस्तेमाल किया जा चाहिए.
Technovit 7100 तैयारी समाधान नरम किट के साथ प्रदान की, यदि आवश्यक समाधान के छोटे aliquots के साथ मिलाया जा सकता है, लेकिन अधिक से अधिक 5% के लिए तैयारी समाधान की मात्रा, हमारे अनुभव में नरम समाधान शायद ही कभी आवश्यक है. निरपेक्ष इथेनॉल और आधार तरल Technovit 7100 के बराबर भागों प्रकाश जोखिम कम से कम 24 घंटे के लिए एक पूर्व घुसपैठ समाधान के रूप में और आंदोलन के साथ मिश्रित कर रहे हैं और ऊतकों को लागू.
घुसपैठ समाधान तो किया जाता है 1 जी hardener मैं (= 1 बैग) जो 100 मिलीलीटर आधार तरल में भंग कर रहा है का उपयोग कर. यह पूर्व - घुसपैठ समाधान की जगह है और लगातार आंदोलन के तहत एक सप्ताह के लिए घुसपैठ की अनुमति दी है.
मोल्ड में काटने की सतह चेहरे के साथ नीचे ऊतक, प्लेस. सुनिश्चित करें राल के लिए ऊतक के चारों ओर एक मार्जिन (आदर्श कम से कम 5 मिलीमीटर) है, इस ब्लॉक शक्ति सुनिश्चित करता है. Hardener द्वितीय के 1 मिलीलीटर के साथ Technovit 7100 की तैयारी समाधान के 15mls मिक्स और मोल्ड में नमूना आसपास डालना और यह कम से कम 5 millimietres कवर. इलाज 2 घंटे के भीतर शुरू, लेकिन रात भर पूरा हो जाएगा.
बढ़ते तो एक समर्थन 3040 Technovit (Heraeus Kulzer) का उपयोग कर ब्लॉक fashioning के द्वारा किया जाता है. 2 भाग 1 तरल और पाउडर के लिए एक चिपचिपा तरल प्राप्त भागों की एक मात्रा के अनुपात में 3040 Technovit मिक्स. ब्लॉक के आधार के ऊपर कम से कम 2 मिमी की एक स्तर पर ब्लॉक के पीछे अवकाश में 3040 Technovit डालो. के बारे में 10 मिनट के बाद मोल्ड खुली दूर किया जा सकता है और ब्लॉक के लिए तैयार है.
घनत्व और इसलिए methacrylate राल के काटने गुण कमरे में परिवेश नमी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. ब्लॉक इसलिए एक dessicator में संग्रहित किया जाना चाहिए.
ग्राउंड सेक्शनिंग मोटाई में 20-50 माइक्रोमीटर के बीच बड़ा वर्गों का उत्पादन. यह fluorochrome विश्लेषण के लिए उपयोगी है (नीचे अनुभाग देखें) के रूप में मोटा वर्गों उज्जवल प्रतिदीप्ति का उत्पादन. Macrotome हीरा ब्लेड सुरक्षित. पेट्रोलियम भावना जैसे स्नेहक, macrotome पर जलाशय के लिए जोड़ें. क्लैंप में ब्लॉक सुरक्षित और ब्लेड से मालूम. धीरे धीरे होते हैं (अनुभाग प्रति लगभग 20-30 मिनट) पर्याप्त स्नेहन सुनिश्चित करने पीसने की अनुमति दें. प्रथम खंड काटने चेहरे को उजागर करता है और धारा यह त्याग किया जाना चाहिए orientates.
अगले अनुभाग तो एक Superfrost प्लस स्लाइड पर रखा गया है. अनुभाग कर्ल ताकि हम इसे पर एक सैंडविच बैग के एक हिस्से को रखने सलाह देते हैं और फिर एक और जगह में स्लाइड clamped के साथ फ्लैट धारण करने की प्रवृत्ति है. यह तो 1 घंटे के लिए 60-80 डिग्री सेल्सियस के बीच की एक मशीन में रखा है. यह methacrylate softens और खंड एक फ्लैट तरीके में स्लाइड का पालन में मदद करता है.
भूमि खंड और साफ किया जा सकता है पॉलिश के रूप में एक सौम्य तरीके से ठीक धैर्य sandpaper का उपयोग करने की आवश्यकता है.
स्लेज सूक्ष्म तक्षणी पतली वर्गों में कटौती, जो प्रकाश microsocopy के लिए सबसे अच्छा वर्गों प्रदान करता है. एक स्लेज सूक्ष्म तक्षणी का प्रयोग के रूप में यह कठोरता, जो इन कठिन ब्लॉक काटने के लिए आवश्यक है जोड़ा गया है. वैकल्पिक रूप से संचालित रोटरी सूक्ष्म तक्षणी इस्तेमाल किया जा सकता है. एक तेज स्टेनलेस स्टील ब्लेड का उपयोग करें. यह बेहतर है के लिए दो उपलब्ध ब्लेड के रूप में एक दूसरे के रूप में तेज किया जा सकता है प्रयोग किया जाता है. ब्लेड ब्लॉक के साथ एक 45 डिग्री के कोण बनाना चाहिए. रrface नरम ब्लॉक करने के लिए एक गीला कागज लागू करने, यदि आवश्यक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यह कई वर्गों लेने के लिए वांछित काटने शर्तों को प्राप्त करने के लिए एक गुणवत्ता अनुभाग प्राप्त कर सकते हैं. अनुभाग तब एक पानी के स्नान पर जारी है और 16 ऊपर के रूप में एक स्लाइड पर रखा है.
धुंधला अभिकर्मकों नीचे सामग्री में सूचीबद्ध हैं. प्रोटोकॉल ⁴ Bancroft एट अल पर आधारित हैं. मोटाई भिन्नता के कारण यह परीक्षण स्लाइड्स पर दाग अनुकूलन के लिए सिफारिश की है. रैक धुंधला ऊतक दाग सीधे एक फ्लैट स्लाइड जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है ताकि स्लाइड बंद फ्लोट करने का कारण हो सकता है. एक समान प्रोटोकॉल या रैक धुंधला अनुरूप धुंधला histomorphometry के लिए आवश्यक परिणामों के लिए आवश्यक है.
1. Haematoxylin और Eosin
  1. Haematoxyilin 5-10 मिनट के साथ दाग
  2. स्कॉट नल का पानी के साथ अच्छी तरह से धो
  3. Eosin 5 मिनट के साथ दाग
  4. नल के पानी में धो
  5. Xylene में साफ़
  6. माउंट
  7. परिणाम
    1. Osteoid = गुलाबी
    2. Calcified हड्डी = थोड़ा बैंगनी भूरे रंग
    3. नाभिक = नीले
2. वॉन Kossa
  1. चांदी नाइट्रेट समाधान में रखें और मजबूत प्रकाश को बेनकाब mineralized हड्डी तक काला हो जाता है (लगभग 10 मिनट)
  2. आसुत जल में तीन बार धो
  3. सोडियम thiosulfate के साथ 5 मिनट के लिए खतरा
  4. आसुत जल में धो डालें
  5. Safrinin हे के साथ Counterstain
  6. Xylene में साफ़
  7. माउंट
  8. परिणाम
    1. Mineralised हड्डी = काला
    2. Osteoid = लाल / गुलाबी
3. मैसन Goldner एस Trichrome
  1. क्षारीय शराब से धो (80% इथेनॉल और 90mls 20 मिनट के लिए 25% अमोनिया की 10mls)
  2. पानी में कुल्ला
  3. आसुत पानी में कुल्ला
  4. 10 मिनट के लिए एस Weigert Haematoxylin साथ दाग
  5. आसुत पानी में कुल्ला
  6. काकरेज़ी रंग Fuchsin अंतिम समाधान 5 मिनट के साथ दाग
  7. 1% एसिटिक एसिड के साथ 15 सेकंड कुल्ला
  8. Phosphomolybdic एसिड नारंगी जी समाधान 5 मिनट में दाग
  9. 1% एसिटिक एसिड के साथ 15 सेकंड कुल्ला
  10. हल्के हरे रंग के 5 मिनट के साथ दाग
  11. 1% एसिटिक एसिड के साथ 3 परिवर्तन कुल्ला
  12. आसुत पानी में कुल्ला
  13. माउंट
  14. परिणाम
    1. Mineralised हड्डी = हरे
    2. Osteoid = लाल / नारंगी
    3. नाभिक = नीले ग्रे
    4. उपास्थि = बैंगनी
Fluorochrome तैयारी:
ये धीमी अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा प्रशासित रहे हैं, कम से कम दो सप्ताह के अलावा.
खुराक
1. Calcein चतुर्थ 10 मिलीग्राम / किग्रा ग्रीन
2. Oxytetracycline 50 मिलीग्राम / किग्रा चतुर्थ
3. Alizarin चतुर्थ 30 मिलीग्राम / किग्रा Complexone
Calcein ग्रीन की तैयारी
1. Calcein ग्रीन की एक ग्राम 1 एम NaOH साथ titrated जब तक भंग किया.
2. पीएच 1% NaOH के साथ पीएच = 7.1-7.2 तक समायोजित है.
3. फ़िल्टर और प्रकाश से परिरक्षित रखने
Alizarin Complexone की तैयारी
1. Alizarin complexone के तीन ग्राम 1 एम NaOH साथ titrated है जब तक भंग.
2. पीएच तो = पीएच 7.1-7.2 तक 1% एचसीएल या NaOH के साथ समायोजित.
3. फ़िल्टर और प्रकाश से परिरक्षित रखने
Oxytetracycline की तैयारी
1. Oxytetracycline शेल्फ से एक विरोधी माइक्रोबियल दवा के रूप में उपलब्ध है. कोई तैयारी नहीं की आवश्यकता है.

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Acknowledgments

लेखकों के लिए उसकी विशेषज्ञता के लिए राल और उसे प्रयोगशाला विशेषज्ञता के लिए एम्बेडिंग सुश्री Stephania मकबरों में सुश्री मुकदमा Connell की सहायता को स्वीकार करना होगा. लेखकों के लिए उनकी सलाह के लिए प्रोफेसर फ्रैंक Kandziora और डॉ. Marie-ऐनी Polboth धन्यवाद देना चाहूंगा.

References

Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
An, Y. H., Martin, K. l Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).
Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).