Biology

Undecalcified Подготовка костей для гистологии, гистоморфометрии и флуорохромами Анализ

Published: January 8, 2010 doi: 10.3791/1707

Tony Goldschlager¹, Amany Abdelkader¹, Jeffrey Kerr², Ian Boundy², Graham Jenkin¹

¹Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, ²Anatomy and Developmental Biology, Monash University

Summary

Undecalcified гистологии костей дает важную информацию для различных клинических и научных исследований. Это технически сложно, особенно крупные экземпляры размером. В этом видео показан процесс получения хороших разделы качества и демонстрирует технические трудности и методы их преодоления.

Abstract

Undecalcified гистологии костей показывает, микро-архитектуру кости. Он показывает, как минерализованные и клеточных компонентов кости, что обеспечивает жизненно важную информацию об обороте кости или образования и резорбции кости. Это имеет огромное значение в различных клинических и научных исследований. Она дает прекрасные образы ¹ и позволяет такие методы, как флуорохромом оценки и гистоморфометрии ^2. Флуорохромами анализ техники, где флуоресцентные красители, которые связываются с кальцием вводятся в определенный момент времени, что позволяет количественно оценить количество минерализации в то время. Гистоморфометрии это процесс количественного кости на микроскопическом уровне.

Выполнение undecalcified гистологии костей является технически сложной задачей, особенно в крупных особей размера. Это требует изменения техники от используемых в стандартных парафин гистологии. В этом видео показан процесс получения хороших разделы качества и демонстрирует технические трудности и методы их преодоления. Подготовка образца, фиксации и обработки достигаются при аналогично других мягких тканей, однако из-за плотности и нижней проницаемость костей значительно больше времени, фиксации и обработки пояс требуется, часто занимает несколько недель. Вложение достигается с помощью поддержки среду с таким же или близким твердость и плотность кости, такие как метакрилат основе смол, но в отличие от проникновения парафина и вложение, это необратимый шаг. Секционирование может быть достигнуто путем измельчения, которая производит толстый раздел, который является оптимальным для исследования, такие как флуорохромом анализа. Лучше всего это достигается с помощью алмаза лезвие на macrotome. Кроме того, тонкие разделы могут быть произведены для световой микроскопии и это достигается с помощью саней микротома с очень острым лезвием. Сани микротома обеспечивает дополнительную прочность и устойчивость, необходимые для больших, жестких блоков. Смола срезы могут быть окрашены в различные пятна, которые демонстрируются.

Protocol

Ткань помещается в герметичный контейнер, содержащий 10% фосфатным буферным раствором формалина ^3. Обеспечить минимальное воздействие света, если флуорохромом анализ должен быть выполнен, так как флуорохромами являются светочувствительными.
Установить, какая ориентация ткани потребуется.
Trim образца до размеров, в правильной ориентации, с помощью ленточной пилы. Обеспечить меры безопасности соблюдаются. Образец помещается в непрозрачный контейнер, объем которой должен быть примерно в десять раз размер образца для достижения адекватной фиксации. Образца должны оставаться в растворе формалина в общей сложности от одной до двух недель в зависимости от его размера. Он предложил использовать контроль ткани для тестирования и оптимизации.
Проверьте ткани вписывается вложение формы и места ткани в запечатанных непрозрачных контейнер, содержащий 70% этанола.
Процесс ткани в порядке возрастания концентрации этанола, защищая от света и при постоянном перемешивании.
1. 70% этанола, 1 неделя
2. 80% этанола, 1 неделя
3. 90% этанола, 1 неделя
4. 100% этилового спирта 1 неделю
Ткань затем очищается в бутаноле в течение 1 недели, опять же защита от света и при постоянном перемешивании.
Плотность смолы и кости должны быть тесно согласованы. Смолы плотностью могут быть изменены (см. шаг 8), и мы рекомендуем вложение первого испытательного образца для обеспечения правильной плотности. Мы используем Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) для световой микроскопии и флуорохромов анализа. Если иммуногистохимии требуется альтернативных смол должны быть использованы такие как Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
Technovit 7100 раствора препарата можно смешивать с небольшим аликвоты смягчение решение поставляемые в наборе, при необходимости, но не более чем на 5% объема раствора препарата, в нашем опыте смягчения решения требуется редко. Равные части абсолютного этанола и базы жидких Technovit 7100 смешивают и наносят на ткань в качестве предварительного проникновения решение в течение 24 часов минимизации освещенности и при перемешивании.
Инфильтрации раствор затем составили использованием 1 г отвердителя я (= 1 мешок), который растворяют в 100 мл жидкой основе. Это заменяет предварительной инфильтрации решение и позволила проникнуть в течение 1 недели при постоянном перемешивании.
Место ткани в форме, с режущей поверхностью вниз лицом. Убедиться, что имеется запас (в идеале не менее 5 миллиметров) вокруг ткани для смол, что обеспечивает прочность блока. Смешайте 15mls из Technovit 7100 подготовке раствора с 1 мл отвердителя II и залить вокруг образца в форму и покрыть ее, по крайней мере, 5 millimietres. Лечение начнется в течение 2 часов, но будет завершена в одночасье.
Монтаж затем выполняется создании блока с помощью поддержки Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Смешайте Technovit 3040 в объемном соотношении 2 части порошка на 1 часть жидкости для получения вязкой жидкости. Налейте Technovit 3040 в вырез в задней части блока до уровня не менее 2 мм выше основания блока. Примерно через 10 минут плесень может быть очищены прочь и блок готов.
Плотность и, следовательно, режущие свойства метакрилата смолы чувствительны к влажности окружающего воздуха в помещении. Блоки следует хранить в эксикаторе.
Земля секционирования производит более широкие слои между 20-50 мкм в толщину. Это полезно для флуорохромом анализа (см. ниже), как толстый разделы производят яркое флуоресценции. Безопасные алмаз лезвие macrotome. Добавить смазки, такие как дух нефтепродуктов в водохранилище на macrotome. Закрепите блок в зажим и ориентироваться на лезвие. Разрешить шлифовальные происходить медленно (примерно 20-30 минут в разделе) обеспечение адекватной смазки. Первый раздел раскрывает резки лицо и ориентируется разделе-она должна быть отброшена.
Следующий раздел помещается на предметное стекло SuperFrost Plus. Раздел имеет тенденцию к скручиванию, поэтому мы рекомендуем размещать часть сэндвич мешок над ним, а затем провести его квартире с другой слайд зажат на месте. Затем помещают в инкубатор между 60-80 градусов Цельсия в течение 1 часа. Это смягчает метакрилат и помогает разделе придерживаться слайда в плоской форме.
Земли разделе, могут быть очищены и отполированы, требуется использование тонкой шкуркой зернистостью в мягкой форме.
Микротома сани сокращений тонких срезов, который обеспечивает лучшее разделы для легких microsocopy. Используйте сани микротома, как он добавил жесткости, которая необходима для резки этих жестких блоков. Кроме питание поворотного микротома могут быть использованы. Используйте острое лезвие из нержавеющей стали. Желательно иметь два контакта доступны как можно уточнить, как другие используют. Лезвие должно углом 45 градусов с блоком. Суrface смягчения может быть достигнуто путем применения мокрой бумаге, чтобы блок, если требуется. Это может занять несколько разделов для достижения желаемого режима резания для получения качества разделе. Секция не плавали на водяной бане и помещают на предметное стекло, как в 16 выше.
Окрашивание реагентов приведены в материалах ниже. Протоколы основаны на Бэнкрофт ⁴ и соавт. В связи с изменением толщины рекомендуется оптимизировать пятна на тестовых слайдов. Стойка окрашивание может привести к ткани плыть за пределы слайда поэтому добавление пятен непосредственно к плоской слайд может потребоваться. Идентичный протокол или стойку окрашивания необходимо согласующихся результатов окрашивания, необходимых для гистоморфометрии.
1. Гематоксилин-эозином
  1. Пятно с Haematoxyilin 5-10 минут
  2. Вымойте и водопроводной водой Скотт с
  3. Пятно с Eosin 5 минут
  4. Стирать в водопроводной воде
  5. Открытый в ксилоле
  6. Монтировать
  7. Результаты
    1. Остеоида = розовый
    2. Calcified кости = пурпурно коричневый
    3. Ядер = синий
2. Фон Косса
  1. Место в раствор нитрата серебра и подвергать воздействию яркого света до минерализованной кости становится черным (около 10 мин)
  2. Стирать в дистиллированной воде в три раза
  3. Угроза с тиосульфатом натрия в течение 5 минут
  4. Стирать в дистиллированной воде
  5. Контрастирующая с Safrinin O
  6. Открытый в ксилоле
  7. Монтировать
  8. Результаты
    1. Минеральная кости = черный
    2. Остеоида = красный / розовый
3. Массон Голднер с Trichrome
  1. Промыть водой с щелочным спиртом (90mls из 80% этанола и 10mls из 25% аммиака в течение 20 минут)
  2. Промойте в воде
  3. Промыть в дистиллированной воде
  4. Пятно гематоксилином Вайгерт с в течение 10 минут
  5. Промыть в дистиллированной воде
  6. Пятно с пунцовый-фуксином окончательное решение за 5 минут
  7. Промыть 1% уксусной кислоты 15 секунд
  8. Пятно в фосфорномолибденовой кислотно-оранжевый G решение за 5 минут
  9. Промыть 1% уксусной кислоты 15 секунд
  10. Пятно со светло-зеленой 5 минут
  11. Промыть 1% уксусной кислоты 3 смены
  12. Промыть в дистиллированной воде
  13. Монтировать
  14. Результаты
    1. Минеральная кости = зеленый
    2. Остеоида = красный / оранжевый
    3. Ядер = синий серый
    4. Хрящ = фиолетовый
Флуорохромами препараты:
Эти находятся в ведении внутривенно медленно, по крайней мере две недели.
Дозы
1. Кальцеин Зеленый 10 мг / кг внутривенно
2. Окситетрациклин 50 мг / кг внутривенно
3. Ализарин комплексона 30 мг / кг внутривенно
Подготовка кальцеин Зеленый
1. Один грамм кальцеин Зеленый титруют 1 М NaOH до полного растворения.
2. рН 1% NaOH до рН = 7.1-7.2.
3. Фильтр и держать защищены от света
Подготовка ализарин комплексона
1. Три грамма ализарин комплексона титруют 1 М NaOH до полного растворения.
2. рН затем корректируются с 1% HCl или NaOH до рН = 7.1-7.2.
3. Фильтр и держать защищены от света
Подготовка Окситетрациклин
1. Окситетрациклин доступен как с полки антимикробных препаратов. Подготовка не требуется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность за помощь г-жа Сью Коннелл для нее опыт в вложение смолы и г-жи Стефании гробниц для нее лабораторной экспертизы. Авторы хотели бы поблагодарить профессора Франка Kandziora и д-р Мари-Анн Polboth за их советы.

References

Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).
An, Y. H., Martin, K. l Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).
Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).