Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الرنين المغناطيسي الطيفي للعيش ذبابة الفاكهة السوداء البطن غزل باستخدام زاوية ماجيك

Published: April 15, 2010 doi: 10.3791/1710
Automatic Translation
1,2,3, 2,4, 2,4, 1,2,3
1NMR Surgical Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Burn Institute, 3Department of Radiology, Athinoula A. Martinos Center of Biomedical Imaging, Harvard Medical School, 4Molecular Surgery Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Summary

هذه التقنية تتيح استخدام السحر زاوية عالية الدقة الغزل بروتون MR الطيفي (HRMAS 1H - MRS) لتوصيف الجزيئي للعيش

Abstract

عالية الدقة ماجيك زاوية الغزل (HRMAS) بروتون التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي (

Protocol

الجزء 1 : ذبابة الفاكهة التحضير لقياسات HRMAS

  1. باستخدام معيار flylab الإجراءات 1 ، وجمع الذباب eclosing حديثا لمدة 3 أيام ، ونقل لهم يطير قارورة تحتوي على المواد الغذائية الطازجة الطيران. احتضان الذباب جمعت لمدة 5 أيام حتى يتسنى للذباب ستصبح 5-8 أيام من العمر قبل لمجرد التجربة. ويستخدم واحد فقط الجنس (الذكور عادة) لإجراء التجارب.
  2. استخدام صحية وسليمة نوع الذباب البرية للمقارنة مع العلاج بالصدمة مثل الذباب أو المعدلة وراثيا 1.
  3. المكان الذباب واحد في أنابيب تحتوي على قطعة 2ml (~ 0.2ml) من 24 ساعة طيران الغذاء قبل التجربة. هذه الأنابيب تحمل ثقبا في الكأس أنبوب أدلى به ابرة الانسولين اللهب ساخنة.
  4. وزن الأنابيب على الفور قبل وبعد الإدراج يطير به توازن عالية الدقة وتحديد وزن كل ذبابة ق بطرح القيمة الأولى من هذا الأخير. وذبابة واحدة تزن الذكور عادة 0،7-1 ملغ.

الجزء 2 : إعداد HRMAS الدوار.

  1. وضع أنبوب واحد على الجليد لمدة تقل عن دقيقة واحدة للتخدير داخل الطيران.
  2. وضع الطيران على طبقة من رقائق الألومنيوم وضعت على الجليد ويدفع برفق يطير في الفضاء جوفاء semispherical لإدراج الدوار الرنين المغناطيسي باستخدام فرشاة ناعمة لضمان إكمال الإدراج يطير مع تجنب الاصابة الطيران.
  3. مكان إدراج في أكسيد الزركونيوم (ZrO 2) أنبوب دوار (4 مم ، 50 ميكرولتر) لتحديد موقع الذباب بين الدوار وإدراج السفلي من الدوار (انظر figure1).
  4. إغلاق إدراج مع المسمار ، وتغطي مع parafilm (انظر figure1) لمنع الاحتكاك بين الذبابة والحل القياسية TSP (TSP : trimethylsilyl البروبيونيك - 2 - ،2،3،3 - D4 حمض = 172 ميغاواط ، δ = 0.00 جزء في المليون ، 50 ملم في المياه deuterated - D 2 O ، أن تكون بمثابة مرجع لكل من الرنين التحول الكيميائي والكمي).
  5. إضافة 8 ميكرولتر من محلول TSP القياسية على أعلى إدراج الدوار. (انظر الشكل 1).
  6. آمنة وتشديد كلها التي أقيمت في الدوارات مع غطاء رأس (انظر الشكل 1).

الجزء 3 : HRMAS البيانات اقتناء

  1. أعرض الدوار في التحقيق HRMAS وضعه في زاوية السحر 54.7 درجة (انظر الشكل 1).
  2. ضبط درجة حرارة 4 درجات مئوية وحدة BTO - 2000 بالاشتراك مع وحدة هوائي ماس. يتم الاحتفاظ الذباب عند 4 درجة مئوية بينما في مطياف للحفاظ على التخدير.
  3. تعيين 1 HRMAS معدل MRS H الغزل في ماس 2 كيلو هرتز.
  4. استقرار وتيرة التناوب ماس ب 2.0 ± 0.001 كيلو هرتز قبل وحدة تحكم السرعة ماس (تردد الدوران).
  5. لإعداد مغناطيس : تناغم وتطابق الملف الأداء الأمثل والرقائق المغناطيس للحصول على جودة أفضل من الأطياف.
  6. الحصول على واحد الابعاد أطياف H 1 باستخدام الدوار متزامنة كار ، بورسيل - Meiboom - جيل (CPMG) تسلسل تدور نبض الصدى 2 ، [90 درجة -- (τ - 180 ° -- τ) ن اقتناء] ، والذي يعمل كعامل تصفية ل2 T إزالة الطيفية 1 H NMR توسيع واحد يطير إلى أطياف المكتسبة أحادية البعد بيانات عن جميع العينات. تزامن هذا التأخير بين نبض (τ = 500μs) على وتيرة التناوب ماس (2 كيلو هرتز). تعيين عدد العابرين في 256 مع 32768 (32K) نقاط البيانات. اكتساب الوقت 9 دقيقة.
  7. الحصول على ثنائي الأبعاد (2D) 1 H - 1 H NMR HRMAS احد يطير الأطياف على جميع العينات باستخدام تسلسل TOBSY مع نبضات مكظوم الحرارة 3. المعلمات اقتناء هي : البعد 2K نقاط البيانات مباشرة (11 جزء في المليون عرض الطيفية) ، 1 ق المياه قبل التشبع خلال تأخير الاسترخاء ، و 8 في زيادة عمليات التفحص ، 128 زيادات ، والوقت 2 ثانية التكرار الإجمالي ، و 45 مللي وقت الخلط ، والاستحواذ الكلي الوقت من 29 دقيقة.

الجزء 4 : معالجة البيانات / تحليل

  1. تحليل العينات باستخدام MRspectra MestReC البرمجيات (Mestrelab البحوث وwww.mestrec.com)
  2. استخدام خط الدالة توسيع apodization 0.5 هرتز وتنطبق على جميع FIDS HRMAS H 1 فورييه قبل التحول.
  3. مرجع أطياف MR فيما يتعلق TSP في δ = 0.0 جزء في المليون (معيار خارجي).
  4. أطياف المرحلة يدويا وتطبيق مقدر الأساس ويتاكر للطرح واسعة من المكونات الأساس لحسابات المنطقة قبل الذروة.
  5. تقدير المناطق الذروة باستخدام البرمجيات MestReC. مرتفعات ذروة النطاق فيما يتعلق TSP لكل الطيف المكتسب (TSP ذروة الارتفاع = 1). ر استخدام اختبارات (اثنان الذيل ، ف <0.05) مقارنة داخل المجموعة بين مجموعات النسب.
  6. معلمات 2D عملية TOBSY هي : وظيفة النافذة QSINE = 2 في كل الأبعاد ، مع نقاط FT 2K في البعد المباشر وصفر لملء 1K في البعد الثاني ، في كل مرحلة التصحيح والتصحيح أبعاد أساسية في البعد الثاني.
  7. إنتاج أطياف 2D باستخدام برنامج سباركي (TD غودارد وKneller DG ، الباشق 3 ، USCF ، http://www.cgl.ucsf.edu/الوطن / الباشق /)

الجزء 5 : أطياف من الممثل ايف ذبابة الفاكهة السوداء البطن الذباب

ووصف الإجراءات المذكورة أعلاه تسمح لجمع أطياف استنساخه من الذباب يعيش melanogaster ذبابة الفاكهة. أرقام 2 و 3 تظهر ممثل أطياف MR المكتسبة في البرية من نوع (وزن) أوريغون - R الذباب. ويعرض الشكل 2 1 H 1D أطياف CPMG HRMAS. مكونات الدهون الرئيسية [C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C H 2 C - CO (1.58ppm) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون)] ، الجلسرين (1،3 H - C 4.10 جزء في المليون والمليون 4،30 ؛ 2 - CH 2 5،24 جزء في المليون) ، والأيضات الصغيرة : β - ألانين (β علاء تم الكشف عن 2،57 جزء في المليون) ، أسيتات (AC ، 1.97 جزء في المليون) ، phosphocholine (PC ، 3.22 جزء في المليون) وphophoetanolamine (PE ، 3.23ppm) والمعينين وفقا للتقارير السابقة 4 ، 5. تم تعيين إشارات إلى 2،02 جزء في المليون لالبروتونات الميثيلين من شاردة C = CH - CH H2 من أحادية الأحماض الدهنية غير المشبعة (أي palmitoleic). تم التعرف على الأحماض غير المشبعة بإشارة 5.33 جزء في المليون في البروتونات التي تنتجها من طراز CH - CH - = شاردة. تم الكشف عن الأيضات الصغيرة التي لا يمكن التنازل عنه أو لم تكن مرئية باستخدام الطيف 1D 2D باستخدام 1 H - 1 H TOBSY HRMAS (انظر الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. تجريبية من إعداد في الجسم الحي HRMAS 1H MRS للتحقيق في العيش في ذبابة الفاكهة الحمضية ،2،3،3 14.1 - D4 T. الخارجية القياسية trimethylsilyl البروبيونيك - 2 - في الماء deuterated (TSP / D 2 O). في الساحة : موقف الدوار في زاوية السحر في التحقيق HRMAS.

الشكل 2
الشكل 2. المجراة 1D HRMAS 1 الأطياف CPMG H من ذبابة الفاكهة ذبابة حية بالوزن melanogaster. مكونات الدهون : C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C C - H 2 CO (1.58ppm) ، خلات (ميلان) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، β - ألانين (β علاء) ، phosphocholine (PC) وphophoetanolamine (PE) ، الجلسرين (1،3 - C H 4.10 ، 4.30 جزء في المليون ، 2 - C H 2 5،22 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون).

الشكل 3
الشكل 3. المجراة في 2D 1H - 1H وقد تم تحديد TOBSY HRMAS طيف ذبابة ذبابة الفاكهة تعيش في وزن melanogaster الأيضات T. 14.1 الصغيرة ومكونات الدهون. الأيضات : ألانين (علاء) ، β - ألانين (β علاء) ، أرجينين (الارجنتين) ، الجلوتامين (GLN) ، الغلوتامات (حمض الغلوتاميك) ، phosphocholine PC (PC) ، phophoetanolamine (PE) ، توراين (تاو) ، α - الجلوكوز (α - GLC) والجلسرين. مكونات الدهون : C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C C - H 2 CO (1.58 جزء في المليون) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع استثناء من التقرير الأخير للجدوى في التصوير بالرنين المغناطيسي المجراة في ذبابة الفاكهة 6 ، في الدراسات المجراة في ذبابة الفاكهة MRS لم يتم الإبلاغ عنها. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف تنفيذ رواية في HRMAS فيفو نهج H - 1 MRS للكشف عن جزيئات هامة بيولوجيا. على وجه التحديد ، اكتشفنا الدهون والأيضات صغيرة في ذبابة الفاكهة تعيش في الذباب في ما يقرب من 14.1 T 45 دقيقة ، مما يتيح الوقت الكافي للشراء ، مع تحقيق معدل وفيات صفر الطيران. يسمح للاستخدام الدوار متزامنة WURST - 8 نبض مكظوم الحرارة (C9 1 15) في TOBSY لنا للحصول على SNR مرضية وقرار جيد من أطياف النسيج النسبية لاستخدام نبض an خلط الخواص (MLEV - 16) ، بالاتفاق مع السابقة تقارير 3 و 7. قدرتنا على استخدام TOBSY للكشف عن ملف تحسين التمثيل الغذائي للذبابة الفاكهة تشير إلى أن استخدام TOBSY مع CPMG 1D غير مناسبة تماما لنوعية في وقت واحد والتحليل الكمي لتركيزات المستقلب وتمكن من تحسين تقييم الخلل في التمثيل الغذائي ذبابة الفاكهة.

نهجنا تقدم المؤشرات الحيوية للتحقيق نماذج الطبية الحيوية في حين دفع عجلة التنمية من جديد في الجسم الحي النهج البحوث غير المدمرة في ذبابة الفاكهة ، وبالتالي قد توجيه التنمية العلاجية الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها مستشفى ماساتشوستس العام أبحاث الحيوان المؤسسية اللجنة مراجعة المجلس.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة لورانس G. AI063433 رحمة ، معهد المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مركز غرانت (P50GM021700) لرونالد تومبكينس G. (A. الأغنية Tzika ، مدير جوهر الرنين المغناطيسي) ، ومستشفى للأطفال في Shriner منحة بحثية (# 8893) إلى ألف الأغنية Tzika. نشكر Dionyssios Mintzopoulos دكتوراه للحصول على المساعدة في المراحل الأولى من تطوير هذا البروتوكول وأوفيديو جيم دكتوراه Andronesi للحصول على المساعدة مع تسلسل نبض TOBSY.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Deuterium oxide Reagent Sigma-Aldrich 7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid Reagent Sigma-Aldrich 24493-21-8
agar, sucrose, yeast, cornmeal Food Genesee Scientific http://www.flystuff.com/
Oregon RS or Canton-S flies Adult fly lines Bloomington Stock center http://flystocks.bio.indiana.edu/
Paintbrush Equipment (size 0)
2ml tubes Equipment Fisher Scientific K749521-1590
Fly incubators Equipment high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle.
Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe Equipment Bruker Corporation
BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit Equipment Bruker Corporation
4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) Equipment Bruker Corporation B3829 (Bruker store)
MestReC (Mestrelab Research) Software 1D NMR spectra analysis
http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCF Software 2D NMR spectraanalysis
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
  2. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
  3. Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
  4. Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
  5. Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
  6. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
  7. Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 38 ، الرنين المغناطيسي الطيفي (MRS) ، وارتفاع القرار غزل زاوية ماجيك (HRMAS) وتوتال ، من خلال التحليل الطيفي بوند الارتباط (TOBSY) ، ذبابة الفاكهة السوداء البطن
الرنين المغناطيسي الطيفي للعيش<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em> غزل باستخدام زاوية ماجيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Righi, V., Apidianakis, Y., Rahme,… More

Righi, V., Apidianakis, Y., Rahme, L. G., Tzika, A. A. Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning. J. Vis. Exp. (38), e1710, doi:10.3791/1710 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter