Summary
이 기술은 생활의 분자 특성에 대한 양성자 MR 분광법 (1H - MRS HRMAS)를 회전 고해상도 마법 각도의 사용을 가능하게
Abstract
고해상도 매직 각도 스피닝 (HRMAS) 프로톤 자기 공명 분광 (
Protocol
1 부 : HRMAS 측정 준비 Drosophila
- 표준 flylab 절차 1을 사용, 새로 3 일간 파리 eclosing 신선한 플라이 음식을 포함하는 튜브를 비행을 전송 수집합니다. 파리 방금 전에 실험 5~8일 이전 될 수 있도록 오일에 대한 수집 파리 알을 품다. 단 하나의 성별은 (보통 남성) 실험에 사용됩니다.
- 건강을 사용, 손상 야생 유형은 예를 들어 충격이나 유전자 파리 1 개조 치료와 비교 날아.
- 이전 실험 비행 식품 24 시간 조각 (~ 0.2ml)을 포함 2ml 튜브에 하나의 파리를 놓습니다. 이러한 튜브는 불꽃 - 온수 인슐린 바늘을 사용하여 만든 튜브 컵에 구멍을 부담.
- 고정밀 밸런스를 사용하여 비행 삽입 전후 바로 튜브를 저울질하고 후자에서 첫 번째 가치를 빼서 각 비행기의 무게를 정의합니다. 한 남자 비행은 일반적으로 0.7-1 MG 무게.
2 부 : HRMAS의 로터 준비.
- 플라이 내부를 마취하는 분도 위해 얼음에 하나의 튜브를 놓으십시오.
- 얼음에 위치 알루미늄 호일의 레이어에 파리를 틀어서 플라이 부상을 피하면서 전체 비행 삽입을 보장하기 위해 부드러운 브러시를 사용하여 NMR의 회전자의 삽입의 semispherical 빈 공간으로 부드럽게 날아 밀어.
- 회전자의 회전자 삽입하고 아래 (figure1 참조) 사이의 파리를 찾습니다 지르코늄 산화물 (ZrO 2) 로터 튜브 (4mm 직경 50 μl)에 삽입 놓습니다.
- 나사와 삽입을 닫고 비행 및 TSP 표준 용액 (TSP 사이의 접촉을 방지하기 위해 parafilm (figure1 참조)로 커버 : δ trimethylsilyl - 프로피 - 2 ,2,3,3 - D4 산, MW = 172, = 0.00 PPM, 진정제를 맞았을 물에 - D 2 O, 공명 화학 변화와 부량 모두에 대해 참고로 그 함수)에서 50 MM.
- 회전자 삽입 위에 TSP 표준 용액의 8 μl를 추가합니다. (그림 1 참조).
- 안전하고 (그림 1 참조) 최고의 모자와 로터에 설정된 전체를 조입니다.
파트 3 : HRMAS 데이터 수집
- HRMAS 프로브에 날개를 소개하고 마법의 각도 54.7 ° (그림 1 참조)에서 위치를.
- MAS의 공압 장치와 함께 BTO - 2000 단위로 4 ° C에서 온도를 설정합니다. 파리는 마취를 유지하는 분광계 4 ° C의 동안에 보관됩니다.
- 2 kHz에서 매스에서 HRMAS 1 H MRS 회전 속도를 설정합니다.
- MAS 속도 컨트롤러 (회전 주파수)에 의해 2.0 ± 0.001 kHz에서에서 MAS 회전 주파수를 안정화.
- 자석 준비 : 조정 및 최적의 성능과 심 스펙트럼의 최적의 품질에 대한 자석 코일을 일치합니다.
- 에 T 2 필터로 작동 [N - 인수 - - (τ τ - 180 °) 90 °], 카 - 퍼셀 - Meiboom - 길 (CPMG) 스핀 에코 펄스 시퀀스 2, 동기 로터를 사용하여 1 차원 1 H 스펙트럼을 취득 모든 샘플 한 차원 데이터를 획득하기 위해 스펙트럼 확대 1 H NMR 단일 플라이 스펙트럼을 제거합니다. MAS 회전 주파수 (2 kHz에서)에 간 펄스 지연 (τ = 500μs) 동기화. 32,768 (32K) 데이터 지점과 256에 과도의 개수를 설정합니다. 수집 시간 9 분.
- 단열 펄스 3 TOBSY 순서를 사용하는 모든 샘플에서 2 차원 (2D) 1 H - 1 H NMR HRMAS 단일 플라이 스펙트럼을 습득. 인수 매개 변수는 다음과 같습니다 2K 데이터 포인트를 직접 치수 (11 PPM 스펙트럼 폭), 1 S 완화 지연 중에 물을 미리 채도, 증가 당 8 스캔, 128 단위, 2의 총 반복 시간, 45 MS 믹싱 시간, 총 인수 29 분 시간.
4 부 : 데이터 처리 / 분석
- MestReC 소프트웨어 (Mestrelab 연구 www.mestrec.com)를 사용하여 표본의 MRspectra를 분석
- 0.5 Hz의 라인 확대 apodization 기능을 사용하여 이전 푸리에 변환에 대한 모든 HRMAS 1 H의 FIDs에 적용됩니다.
- δ = 0.0 PPM (외부 규격)에서 TSP와 관련하여 MR 스펙트럼을 참조.
- 수동 스펙트럼 위상 및 사전 피크 면적 계산에 대한 기준의 광범위한 구성 요소를 뺄 휘태커 기준 견적 도구 (Traffic Estimator)를 적용합니다.
- MestReC 소프트웨어를 사용하여 최대 영역을 예상하고있다. 존중 스케일 최고점은 각 인수 스펙트럼 (TSP 피크 높이 = 1) TSP 수 있습니다. 사이 그룹 비율로 내에서 - 그룹을 비교하는 T - 테스트 (2 꼬리, P는 <0.05)를 사용합니다.
- 2D TOBSY 프로세스 매개 변수는 다음과 같습니다 두 차원에 QSINE = 2 창 기능, 직접 치수 두 번째 차원, 두 번째 차원의 두 차원과 기본 수정의 위상 보정에 1K에 제로 채울 2K 점 FT.
- 스파키 프로그램 (TD 고더드 및 DG 넬러, 스파키 3, USCF 사용 2D 스펙트럼 제작 http://www.cgl.ucsf.edu/을홈 / 스파키 /)
제 5 부 : 대표 스펙트럼 라이브 Drosophila melanogaster에서 난다
절차는 라이브 Drosophila melanogaster의 파리에서 재현할 수 스펙트럼을 수집하는 것을 허용 위에서 설명한. 야생 형 (WT) 오레곤 - R 인수 그림 2, 3 쇼 대표 MR 스펙트럼 난다. 그림 2 선물 1D 1 H HRMAS CPMG 스펙트럼에게. 주요 지질 구성 요소 [C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), C H = C H (5.33 PPM)], 글리세롤 (1,3 - C H 4.10 PPM과 4.30 PPM, 2 - CH 2 5.24 PPM), 그리고 작은 metabolites : β - 알라닌 (β - 에이러 , 2.57 PPM), 아세테이트 (AC, 1.97 PPM), phosphocholine (PC, 3.22 PPM)와 phophoetanolamine (PE, 3.23ppm)를 감지하고 사전에보고 4, 5에 따라 배정했다. 2.02 PPM에서 신호는 모노 - 불포화 지방산 (즉 palmitoleic)의 C H2 - CH = CH 잔기의 메틸렌의 양자에 할당되었습니다. 불포화 지방산은 - CH = CH - 잔기의 양자에 의해 만들어진 5.33 PPM에서 신호를 식별했습니다. 할당할 수 없습니다거나 1D 스펙트럼을 사용하여 표시되지 않은 수 작은 metabolites은 2D 1 H - 1 H를 사용하여 감지되었습니다 TOBSY HRMAS (그림 3 참조).
그림 1. 실험은 생체내에의 준비 진정제를 맞았을 물에 14.1 T. 외부 표준 trimethylsilyl - 프로피 - 2 ,2,3,3 - D4의 산성 (TSP / D 2 O)에서 살고 Drosophila의 조사 HRMAS 1H MRS. HRMAS 프로브에있는 마법의 각도에서 로터 위치 : 광장에서.
그림 2. Drosophila melanogaster 라이브 WT 날아의 생체내 1D HRMAS 1 H CPMG 스펙트럼에서. 지질 구성 요소 : C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58ppm), 아세테이트 (AC), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), (β - 에이러) β - 알라닌, phosphocholine (PC)와 phophoetanolamine (PE), 글리세롤 (1,3 - C H 4.10, 4.30 PPM, 2 - C H 2 5.22 PPM) , C H = C H (5.33 PPM).
그림 3. 생체내 2D 1H - 1H에 14.1 T. 중소 metabolites 및 지질 구성 요소에 살고 Drosophila melanogaster WT 날아의 TOBSY HRMAS 스펙트럼이 확인되었습니다. Metabolites : 알라닌 (에이러), (β - 에이러) β - 알라닌, 아르기닌 (ARG), 글루타민 (Gln), 글루 탐 산염 (GLU), PC의 phosphocholine (PC), phophoetanolamine (PE), 타우린 (타우), α - 포도당 (α - Glc)과 글리세롤. Lipids 구성 요소 : C H 3 (0.89 PPM), (C H 2) N (1.33 PPM), C H 2 C - CO (1.58 PPM), C H 2 C = C (2.02 PPM), C H 2 C = O (2.24 PPM), C H = C H (5.33 PPM).
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Discussion
과일의 생체내 MRI에의 가능성의 최근 보고서를 제외하고 6 파리, Drosophila의 생체내 MRS 연구 아직보고되지 않았습니다. 현재 프로토콜, 우리는 생물학적으로 중요한 분자를 검출 생체내 HRMAS 1 H - MRS 방식의 소설의 구현을 설명합니다. 제로 파리 사망률을 달성하면서 특히, 우리는 lipids, 라이브 Drosophila의 작은 metabolites 충분한 수집 시간을 허용 약 45 분에서 14.1 T에서 파리를 발견했습니다. TOBSY의 로터 - 동기 워스트 - 8 단열 펄스 (C9 1 15)의 사용은 이전과 계약에 만족스러운 SNR과 등방성 혼합 펄스 (MLEV - 16) 사용에 상대 조직 스펙트럼 좋은 해상도를 얻기 위해 우리를 허용 보고서 3, 7. Drosophila의 개선 대사 프로필을 검색할 수 TOBSY 사용하는 우리의 능력은 TOBSY 1D CPMG와 함께 사용되는 잘 신진 대사 농도의 동시 정성 및 정량 분석에 적합하고 Drosophila의 대사 장애의 개선 평가를 가능하게합니다 제안합니다.
우리의 접근 방식은 Drosophila의 생체내 비파괴 조사 방법에 소설의 개발을 추진하면서 생물 의학 패러다임을 조사하고, 따라서 새로운 치료 개발을 직접 수 있습니다 생체를 제공합니다.
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Disclosures
동물 실험은 매사 추세츠 종합 병원 기관 동물 연구 검토위원회위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 로렌스 G. Rahme에 건강 (NIH) 부여 AI063433의 국립 연구소, 로날드 G. 톰프킨스 (A. 아리아 Tzika의 원장 건강의 국립 연구소 연구소 (NIH) 센터 그랜트 (P50GM021700)에 의해 부분적으로 지원되었다 A. 아리아 Tzika 어린이 연구 부여 (# 8893)에 대한 NMR 코어) 및 슈라 이너 병원. 우리는 Dionyssios Mintzopoulos 박사 감사 이 프로토콜 및 Ovidiu C. Andronesi 박사를 개발의 초기 단계에서 도움을 TOBSY 펄스 시퀀스를 지원.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
