Summary
这项技术使活的分子特征的高分辨率魔角旋转的质子磁共振波谱（1H - MRS HRMAS）
Abstract
高分辨魔角旋转（HRMAS）质子核磁共振光谱（
Protocol
第1部分：准备HRMAS测量果蝇
- 使用标准flylab程序1，收集新eclosing 3天的苍蝇，他们转移到飞瓶含有新鲜飞食品。孵育5天收集到的苍蝇，苍蝇将成为老实验前5-8天。只有一种性别（通常是男性）是用于实验。
- 使用健康，完整的野生型果蝇与治疗如创伤或转基因苍蝇1。
- 放入含有一块飞食品24小时（〜0.2毫升）实验前2毫升管单苍蝇。这些管子承受使用火焰加热的胰岛素针管杯孔。
- 权衡的管飞采用了高精密天平插入之前和之后，并定义每个飞的体重减去后者的第一个值。一个单一的男性飞的重量一般为0.7-1毫克。
第2部分：HRMAS 转子准备。
- 不到一分钟麻醉里面飞单管置于冰上。
- 铺设一层铝箔置于冰上飞，飞轻轻推入使用软毛刷，以确保完成飞行的插入，同时避免飞伤害的NMR转子插入中空的半球形空间。
- 将插入到氧化锆（ZrO 2的 ）转筒（4毫米直径，50μL），定位和转子的转子插入底部（见图1）之间的苍蝇。
- 关闭用螺丝插入和封口膜（见图1）覆盖，以防止飞和TSP的标准溶液（TSP之间的接触：三甲基硅烷基丙酸- 2 ,2,3,3 - D4酸，MW = 172，δ = 0.00 ppm时，氘水- D 2 O，这两个共振化学位移和量化的参考功能）50毫米。
- TSP的转子插入顶部的标准解决方案新增8μL。 （见图1）。
- 安全和收紧了整个设置在顶盖与转子（见图1）。
第3部分：数据采集HRMAS
- HRMAS探头引入转子和魔角54.7 °（见图1）的位置。
- 在结合的BTO - 2000 MAS气动装置的单位，设置在4 ° C的温度。苍蝇都保持在4 ° C，而在光谱仪，麻醉维持。
- 设置在2 kHz的MAS HRMAS 的1 H MRS纺企。
- MAS旋转频率稳定在2.0 ± 0.001千赫的MAS速度控制器（旋转频率）。
- 对于磁铁的准备：调整和匹配最佳的性能和垫片质量最优的光谱磁铁线圈。
- 采集一维的1 H谱使用同步卡尔赛尔Meiboom -吉尔（CPMG）自旋回波脉冲序列2，转子[90 ° - （τ- 180 ° - τ）N -收购，作为T 2过滤工程删除，以收购一维数据，对所有样品的光谱展宽的1 H核磁共振单飞光谱。同步脉冲间的延迟（τ=500μS）的MAS旋转频率（2千赫）。设置在256 32,768（32K）数据点的瞬态。采集时间9分钟。
- 采集二维（2D）的H - 1 H HRMAS核磁共振对所有使用3绝热脉冲一个TOBSY序列样本单飞光谱。采集参数：2K数据点直接的尺寸（11 ppm的谱宽），1预饱和的水松弛延迟期间，8％的增量扫描，128个递增，2秒的总重复时间，搅拌时间45毫秒，总收购29分钟的时间。
第4部分：数据处理/分析
- 分析使用MestReC的软件（Mestrelab研究，www.mestrec.com标本MRspectra）
- 使用一个0.5赫兹扩大切趾的功能，并适用于所有HRMAS的 1 H FID的傅立叶变换之前。
- 参考尊重议员光谱TSP的δ= 0.0 PPM（外部标准）。
- 手动相位谱，和应用惠特克基线估计广泛的组件前，以峰面积计算减去基准。
- 估计使用MestReC软件的峰面积。峰高与定额TSP的每个收购频谱（TSP峰高= 1）。使用t检验（双尾，P <0.05），组内比较组之间的比率。
- 2D TOBSY工艺参数是：在两个维度QSINE = 2的窗口函数，直接维和零填充到1K，在第二个维度，阶段中的第二个维度的尺寸和基线校正校正2K点英尺。
- 使用斯帕克方案（TD戈达德和DG Kneller得利3，USCF， http://www.cgl.ucsf.edu/产生的二维光谱首页/得利/）
第5部分：从Live 果蝇代表光谱苍蝇
上述程序允许收集活果蝇苍蝇重现光谱。图2和图3显示了在野生型（WT）俄勒冈州- R代表致辞光谱收购苍蝇。图2给出了1D 的1 H HRMAS CPMG光谱。主要脂质成分[C H 3（0.89 ppm）的，（2）C H N（1.33 PPM），C H 2架C - CO（1.58ppm），C H 2 C = C（2.02 PPM），C H 2 C = O（2.24 PPM），C H = C H（5.33 PPM），甘油（1,3 - C H 4.10 PPM，4.30 PPM; 2 - CH 2 5.24 PPM），和小的代谢物：β-丙氨酸（β-丙氨酸，2.57 PPM），醋酸乙烯酯（AC，1.97 PPM），phosphocholine（PC，3.22 PPM）和phophoetanolamine（PE，3.23ppm）进行检测，并根据与以前的报告4，第5指派。 2.02 PPM信号被分配到的 C H2 - CH = CH基团的单不饱和脂肪酸（如棕榈油）亚甲基质子。不饱和脂肪酸被确定在5.33 PPM - CH = CH -基团的质子产生的信号。无法分配或使用1D的频谱不可见的小代谢产物检测 2D 1 H - 1 H TOBSY HRMAS（见图3）。
图1。实验设在体内 HRMAS 1H MRS 14.1 T.外标三甲基硅丙酸- 2 ,2,3,3 - D4氘水酸（TSP / D 2 O）的活果蝇调查。在广场：在HRMAS探头魔角转子位置。
图2 在体内 1D HRMAS 的1 H CPMG的一个活的果蝇重飞光谱。脂质成分：C H 3（0.89 ppm）的，（2）C H N（1.33 PPM），C H 2 C - CO（1.58ppm），醋酸（AC），C H 2 C = C（2.02 PPM），C H 2 C = O（2.24 PPM），β-丙氨酸（β- ALA），phosphocholine（PC）和phophoetanolamine（PE），甘油（1,3 - C H，4.30每分钟4.10; 2 - C H 2 5.22 PPM ） C H = C H（5.33 PPM）。
图3。 体内 2D 1H - 1H TOBSY HRMAS现场果蝇重 14.1吨小代谢产物和脂质成分飞的光谱进行了鉴定。代谢物：丙氨酸（ALA），β-丙氨酸（β- ALA），精氨酸（Arg），谷氨酰胺（Gln），谷氨酸（Glu），PC phosphocholine（电脑），phophoetanolamine（PE），牛磺酸（头），α-葡萄糖（α- GLC）和甘油。血脂组件：C H 3（0.89 PPM），（2）C H N（1.33 PPM），C H 2 C - CO（1.58 PPM），C H 2 C = C（2.02 PPM），C H 2 C = O （2.24 PPM），C H = C H（5.33 PPM）。
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Discussion
随着最近在体内 MRI水果中的可行性报告的异常苍蝇6，在果蝇体内MRS研究尚未报道。在本议定书中，我们描述了在体内HRMAS 1 H - MRS检测生物的重要分子方法的小说实施。具体来说，我们检测血脂和小活果蝇的代谢产物在14.1 T苍蝇在约45分钟，它允许有足够的采集时间，同时实现零飞死亡率。使用转子同步WURST 8绝热脉冲（C9 1月 15日 ）在TOBSY允许我们取得了满意的信噪比和良好的组织光谱相对各向同性混合脉冲（MLEV 16）使用的决议，与以前的协议报告3，7。我们使用TOBSY检测提高了果蝇的代谢能力，建议TOBSY 1D CPMG的使用，是非常适合代谢物浓度的同时定性和定量分析，并能够在果蝇中改善代谢功能障碍的评价。
我们的方法提供了生物标志物的调查生物医学范式，同时促进发展的新型非破坏性的研究方法，在果蝇体内，从而可能直接新的治疗发展。
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Disclosures
在马萨诸塞州总医院的机构动物研究审查委员会委员会提出的准则和法规的规定进行动物实验。
Acknowledgments
这项工作是支持部分由一个国家AI063433卫生研究院（NIH）的资助机构，一个国立卫生研究院（NIH）的中心格兰特（P50GM021700）罗纳德G.汤普金斯（A.咏叹调Tzika，主任劳伦斯G. Rahme核磁共振核心），并为儿童的研究经费（＃8893）A.咏叹调Tzika一个Shriner的医院。我们感谢Dionyssios Mintzopoulos博士在本议定书和奥维迪乌C. Andronesi博士开发的初始阶段的援助TOBSY脉冲序列的援助。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
