Summary
この手法は、ライブの分子特性評価のためにプロトンMRスペクトロスコピー（HRMAS 1H - MRS）を回転の高分解能マジック角の使用を可能にする
Abstract
高分解能マジック角スピニング（HRMAS）プロトン磁気共鳴分光法（
Protocol
パート1：HRMAS測定のための準備ショウジョウバエ
- 標準flylab手順1を使用して 、3日間、新たにeclosingハエを収集し、新鮮なフライ食品を含むバイアルを飛ぶためにそれらを転送する。ハエが直前に実験に5-8日の古いとなるように5日間に収集ハエをインキュベートする。唯一の性別は、（通常は男性）の実験に使用されます。
- 健康的な使用、無傷の野生型は、例えば外傷または遺伝的にハエ1を変更扱わと比較して飛ぶ。
- 実験に先立って、フライ食品24時間の一部（〜0.2ミリリットル）を含む2ミリリットルチューブに単一のハエを置きます。これらの管は、火炎加熱インスリンの注射針を使用して作られたチューブのカップに穴を負うものとします。
- 高精度のバランスを使用してフライの挿入前と直後にチューブの重量を測定し、後者からの最初の値を減算することにより、各フライの重みを定義する。シングル男性のフライは、通常、0.7から1ミリグラムの重量を量る。
パート2：HRMASのローターの準備。
- フライの内側に麻酔する分未満の氷の上に単一のチューブを置きます。
- 氷上に置かれたアルミ箔の層の上にフライを置くとハエの傷害を回避しながら、完全なハエの挿入を確実にするために柔らかいブラシを使用してNMRローター挿入の半球状の中空空間にそっとフライを押してください。
- ローターのローターを挿入し、底部（図1を参照）の間にハエを見つけるために酸化ジルコニウム（ZrO 2）ローターチューブ（直径4mm、50μlの）への挿入を置きます。
- δトリメチルシリル-プロピオン- 2 ,2,3,3 - D4酸、分子量= 172、：フライとTSP標準溶液（TSPとの間の接触を防ぐために、ネジ付きインサートを閉じて（図1を参照）パラフィルムをかぶせます= 0.00 ppmの、重水- D 2 O、共鳴の化学シフトと定量の両方のリファレンスとして機能する）で50mMの。
- ローター挿入の上にTSP標準溶液の8μlを添加します。 （図1参照）。
- 固定し（図1参照）トップキャップとローターで設定全体を締めます。
パート3：HRMASデータ収集
- HRMASプローブにローターを紹介し、マジック角54.7 °（図1参照）に配置します。
- MASの空気圧ユニットとの組み合わせでBTO - 2000ユニットで4℃で温度を設定します。麻酔を維持するために分光器中にハエを4℃で保存されています。
- 2 kHzのMASでHRMAS 1 H MRS紡糸速度を設定します。
- MASのスピードコントローラ（回転周波数）が2.0 ± 0.001 kHzでMASの回転数を安定させます。
- 磁石の準備のための：チューニングと最適なパフォーマンスとシムスペクトルの最適な品質のための磁石のコイルと一致している。
- にT 2のフィルタとして機能する[N -買収- - （ττ- 180 °）90 °]、カーパーセル- Meiboom -ギル（CPMG）スピンエコーパルスシーケンス2、同期ローターを用いて一次元1 Hスペクトルを取得する全てのサンプルで一次元のデータを取得するために、スペクトルの広がり1 H NMRシングルフライスペクトルを削除します。 MASの回転数（2 kHz）にパルス間の遅延時間（τ=500μsの）を同期する。 32,768（32K）のデータ点で256でトランジェントの数を設定します。アクイジション時間9分。
- 断熱パルスを3でTOBSYシーケンスを使用して、すべてのサンプルの2次元（2D）1 H - 1 H HRMAS NMRシングルフライスペクトルを取得する。買収のパラメータは次のとおりです。2kのデータポイントの直接の次元（11 ppmのスペクトル幅）、1秒リラクゼーションディレイの間に水プレ飽和、インクリメントあたり8スキャン、128ずつ、2秒の総繰り返し時間、45ミリ秒混合時間、および合計獲得29分の時間。
パート4：データ処理/解析
- MestReCソフトウェアを使用して、標本のMRspectra（Mestrelab研究、www.mestrec.com）を分析する
- 0.5 Hzのライン拡大アポダイゼーション関数を使用し、前にフーリエ変換のすべてのHRMAS 1 HのFIDがに適用されます。
- δ= 0.0 ppmの（外部標準）でTSPに関連してMRスペクトルを参照する。
- 手動でのスペクトル位相と前のピーク面積の計算にベースラインの広範な成分を減算するホイッタカーのベースラインの推定を適用する。
- MestReCソフトウェアを使用してピーク面積を推定する。に関する規模のピーク高さはそれぞれ取得したスペクトル（TSPピークの高さ= 1）のためにTSPに。の間に、グループの比率に、グループ内で比較するt検定（両側検定、P <0.05）を使用してください。
- 2D TOBSYのプロセスパラメータは次のとおりです：両方の次元QSINE = 2窓関数、直接の次元と二次元目、2番目の次元の両方の次元とベースライン補正の位相補正に1kにゼロ充填した2kポイントとFT。
- スパーキープログラム（TDゴダードとDGネラー、スパーキー3、USCF、使用して2次元スペクトルを得るhttp://www.cgl.ucsf.edu/ホーム/スパーキー/）
パート5：ライブキイロショウジョウバエからの代表的なスペクトルハエ
手順は、ライブキイロショウジョウバエのハエから再現性のスペクトルを収集することを許可上記の。野生型（WT）オレゴン- Rで取得した図2と図3に代表的なMRスペクトルが飛ぶ。図2プレゼント1D 1 H HRMAS CPMGスペクトルを。主要な脂質成分[C H 3（0.89 ppm）を、（C H 2）N（1.33 ppm）を、C H 2 C - CO（1.58ppm）、C H 2 C = C（2.02 ppm）を、C H 2 C = O（2.24 ppm）を、C H = C H（5.33 ppm）の]、グリセロール（1,3 - C H 4.10 ppmと4.30 ppmの、2 - CH 2 5.24 ppm）を、と小さな代謝物：β-アラニン（β-アラ、2.57 ppm）を、酢酸（AC、1.97 ppm）を、ホスホコリン（PC、3.22 ppm）とphophoetanolamine（PE、3.23ppm）を検出し、事前の報告4、5に準拠して割り当てられていました。 2.02 ppmのシグナルは、モノ不飽和脂肪酸（すなわち、パルミトレイン）のC H2 - CH = CHの部分のメチレンプロトンに割り当てられていた。不飽和脂肪酸は、- CH = CH -基のプロトンによって生産さ5.33 ppmのシグナルにより同定した。割り当てられていないか、1Dスペクトルを使用して表示されていたことが、小さな代謝物は2次元1 H - 1 Hを用いて検出した TOBSY HRMAS（図3参照）。
図1実験では生体内での設定 重水14.1 T.外部標準トリメチルシリルプロピオン- 2 ,2,3,3 - D4酸（TSP / D 2 O）でのライブショウジョウバエの調査のためのHRMAS 1H MRS。 HRMASプローブでマジック角での回転子位置：正方形で。
図2。ライブキイロショウジョウバエ重量フライの生体 1D HRMAS 1 H CPMGスペクトルで 。脂質成分：C H 3（0.89 ppm）を、（C H 2）N（1.33 ppm）を、C H 2 C - CO（1.58ppm）、酢酸（AC）、C H 2 C = C（2.02 ppm）を、C H 2 C = O（2.24 ppm）を、β-アラニン（β- Ala）を、ホスホコリン（PC）とphophoetanolamine（PE）、グリセロール（1,3 - C H 4.10、4.30 ppmの、2 - C H 2 5.22 ppm）の、C H = C H（5.33 ppm）を。
図3。 生体 2D 1H - 1H の 14.1 T.小型代謝と脂質成分のライブキイロショウジョウバエ重量フライのTOBSY HRMASスペクトルが同定された。代謝産物：アラニン（Ala）、β-アラニン（β- Ala）を、アルギニン（Arg）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（GLU）、PCホスホコリン（PC）、phophoetanolamine（PE）、タウリン（TAU）、α-グルコース（α-グルコース）とグリセリン。脂質成分：C H 3（0.89 ppm）を、（C H 2）N（1.33 ppm）を、C H 2 C - CO（1.58 ppm）を、C H 2 C = C（2.02 ppm）を、C H 2 C = O （2.24 ppm）を、C H = C H（5.33 ppm）を。
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Discussion
果実における in vivo MRI での実現可能性の最近の報告を除いて6ハエ、 ショウジョウバエを用いるin vivo MRS研究ではまだ報告されていない。現在のプロトコルでは、我々は生物学的に重要な分子を検出するためのin vivoで HRMAS 1 H - MRSのアプローチで小説の実装について説明します。ゼロフライ死亡率を達成しながら、具体的には、ライブショウジョウバエで脂質と小さな代謝物を検出すると、十分な収集時間を可能にする約45分、14.1 Tで飛行。 TOBSYのローター同期ソーセージ- 8断熱パルス（C9 1〜15）の使用は、以前と合意の上で、十分なSNRと等方性混合パルス（MLEV - 16）を使用するために相対的な組織スペクトルの優れた分解能を得るために私達を許可レポート3,7。 ショウジョウバエの改良代謝プロファイルを検出するためにTOBSY使用する当社の能力は、そのTOBSY 1D CPMGで使用するだけでなく代謝物濃度の同時定性および定量分析に適しており、 ショウジョウバエの代謝機能不全の改善の評価を可能にすることを示唆している。
我々のアプローチは、 ショウジョウバエの in vivo非破壊研究のアプローチで小説の開発を進めながら、生物医学パラダイムを調査するためにバイオマーカーを提供するため、新たな治療法の開発を指示することができる。
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Disclosures
動物実験は、マサチューセッツ総合病院動物実験の研究レビュー委員会の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
この作品は、ロナルドG.トンプキンス（A.アリアTzika、取締役に衛生研究所（NIH）の助成金ローレンスG. Rahme、衛生研究所（NIH）センターグラント（P50GM021700）の国立研究所研究所のAI063433の国立研究所によって部分的にサポートされていましたA.アリアTzikaの子供の研究助成金（＃8893）のためのNMRのコア）、およびシュリナーの病院。我々はDionyssios Mintzopoulos博士に感謝するこのプロトコルとOvidiu C. Andronesi博士号を開発の初期段階における支援のためのTOBSYパルスシーケンスの支援のための。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
