Summary
Bu teknik, canlı moleküler karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü sihirli açısı proton MR spektroskopi (HRMAS 1H-MRS) iplik kullanımını sağlar
Abstract
Yüksek Çözünürlüklü Magic Açısı İplik (HRMAS) proton manyetik rezonans spektroskopi (
Protocol
Bölüm 1: HRMAS Ölçümler için hazırlanması Drosophila
- Standart flylab prosedürleri kullanma 1, 3 gün boyunca yeni sinekler eclosing ve taze sinek gıda içeren şişeleri uçmak için transfer toplamak. Sineklerin sadece deneme için 5-8 gün önce eski haline gelecektir ki, 5 gün boyunca toplanan sinekler inkübe edin. Sadece bir cinsiyet (genellikle erkek), deneyler için kullanılır.
- Sağlıklı, bozulmamış vahşi tip örneğin, travmatize olmuş ya da genetik olarak değiştirilmiş sinek 1 tedavi ile karşılaştırmak için uçar.
- Tek sinek sinek gıda 24 saat önce deneme için bir parça (~ 0.2ml) içeren 2ml tüp içine yerleştirin. Bu tüpler bir alev ısıtılmış insülin iğne kullanılarak yapılan tüp kap içinde bir delik taşımaktadır.
- Tüpler, yüksek hassasiyetli terazi ile sinek yerleştirilmeden önce ve hemen sonra tartılır ve ikincisi ilk değeri çıkarılarak her sinek s ağırlık tanımlamak. Bir tek erkek sinek genellikle 0,7-1 mg ağırlığındadır.
Bölüm 2: HRMAS Rotor hazırlanması.
- Tek bir tüp içinde sinek uyutmak için bir dakika daha az buz koyun.
- Lay, buz üzerine yerleştirilen alüminyum folyo bir katman üzerinde sinek ve sinek sinek yaralanma kaçınarak tam sinek ekleme sağlamak için yumuşak bir fırça kullanarak NMR rotor eklemek semispherical içi boş uzaya hafifçe itin.
- Rotor rotor yerleştirin ve alt (Şekil 1) arasında sinekler bulmak için eklemek zirkonyum oksit (ZrO 2) rotor tüp (4 mm çap, 50 ul) içine yerleştirin.
- Vida ile ekleme kapatın ve sinek ve TSP standart solüsyon (TSP arasındaki temasını önlemek için parafilm (Şekil 1) ile örtün: δ trimethylsilyl propiyonik-2 ,2,3,3-d4 asit, Mw = 172, = 0.00 ppm döteryumlanmış su-D 2 O, rezonans kimyasal kayma ve ölçülmesi için bir referans olarak işlev gördüğü), 50 mM.
- 8 rotor eklemek üstüne TSP standart çözüm ul ekleyin. (Bkz. Şekil 1).
- Güvenli ve bir üst kapağı ile rotorlar kadar bütün sıkın (bkz. Şekil 1).
Bölüm 3: Veri Toplama HRMAS
- HRMAS prob içine rotor tanıtmak ve sihirli açısı 54.7 ° (bkz. Şekil 1) bu pozisyon.
- MAS pnömatik ünitesi ile birlikte bir birim tarafından BTO-2000 4 ° C'de sıcaklığı ayarlayın. Sinekler anestezi korumak için spektrometre 4 ° C süre tutulur.
- 2 kHz MAS HRMAS 1 H MRS iplik hızı ayarlayın.
- MAS hız kontrol ünitesi (Döndürme frekans) 2.0 ± 0.001 kHz MAS dönme frekansı stabilize eder.
- Mıknatıs hazırlanması için: tune ve optimum performans ve kama spektrumları optimum kalite için mıknatıs bobin maç.
- T 2 filtre gibi çalışır] [n-satın alma - (τ τ-180 °) 90 ° Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin eko darbe dizisi 2, senkronize rotor kullanarak tek boyutlu 1 H spektrumları kazanmak Tüm numuneler üzerinde tek boyutlu veri elde spektral genişletilmesi 1 H NMR tek sinek spektrumları çıkarın. MAS dönme frekansı (2 kHz) darbeli arası gecikmesi (τ = 500μs) senkronize edin. 32.768 (32k) veri noktaları ile 256 Transientlerin sayısını ayarlayın. Zaman kazancı 9 dk.
- Adyabatik bakliyat 3 TOBSY sırasını kullanarak tüm numuneler üzerinde iki boyutlu (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR tek sinek spektrumları edinin. Toplama parametreler şunlardır: 2k veri noktaları doğrudan boyutu (11 ppm spektral genişlik), 1 s gevşeme gecikmesi sırasında su Presatürasyon başına 8 tarama artışla, 128 artışlarla, 2 toplam tekrarlama süresi 45 ms karıştırma süresi ve toplam satın alma 29 dk.
Bölüm 4: Veri İşleme / Analiz
- MRspectra MestReC yazılımı (Mestrelab Araştırma, www.mestrec.com) kullanılarak örneklerin analiz
- 0.5 Hz bir çizgi genişletilmesi apodization fonksiyonu kullanın ve Fourier dönüşümü önce tüm HRMAS 1 H FIDS için geçerlidir.
- Δ = 0.0 ppm (dış standart) TSP ile ilgili MR spektrumları Referans.
- Elle spektrumları Faz ve pik alanı hesaplamaları öncesinde geniş temel bileşenleri çıkarmak için bir Whittaker bazal tahmincisi uygulamak.
- MestReC yazılımı kullanarak pik alanları tahmin. Saygı ile Ölçekli pik yükseklikleri her kökenli spektrumu (TSP tepe yüksekliği = 1) TSP. Gruplar arası oranları grup içinde karşılaştırmak için t-testi (iki uçlu, p <0.05) kullanın.
- 2D TOBSY proses parametreleri: QSINE = iki boyutlu olarak 2 pencere fonksiyonu, 2k doğrudan boyut ve ikinci boyutu, ikinci boyut hem de boyutları ve bazal düzeltme faz düzeltme 1k sıfır dolum noktaları ile FT.
- Sparky programı (TD Goddard ve DG Kneller Sparky 3, USCF, 2D spektrumları üretin http://www.cgl.ucsf.edu/home / Sparky /)
Bölüm 5: Live Drosophila melanogaster Temsilcisi Spectra Sinekler
Yukarıda açıklanan prosedürleri canlı Drosophila melanogaster sinekler tekrarlanabilir spektrumları toplamak için izin. Wild-tip (wt) Oregon-R edinilen Şekil 2 ve 3 gösteri temsilcisi MR spektrumları uçar. Şekil 2 hediyeler 1D 1 H HRMAS CPMG spektrumları. Baş lipit bileşenleri [C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C Y = C H (5.33 ppm), gliserol (1,3-C H 4.10 ppm ve 4.30 ppm; 2-CH 2 5.24 ppm), küçük ve metabolitleri: β-Alanin (β-Ala 2.57 ppm), asetat (Ac, 1,97 ppm), Phosphocholin (PC, 3.22 ppm) ve phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) tespit ve önceki raporlar 4, 5 doğrultusunda tahsis edildi. 2.02 ppm sinyaller mono-doymamış yağ asitleri (yani palmitoleik) C H2-CH = CH benzer parçaları metilen proton ayrıldı. Doymamış asitler 5.33 ppm'de-CH = CH-benzer parçaları protonlar tarafından üretilen bir sinyal tespit edildi. Atanamaz veya 1D spektrum kullanarak görünmez oldular Küçük metabolitleri 2D 1 H-1 H kullanılarak tespit edildi TOBSY HRMAS (bkz. Şekil 3).
Şekil 1. Deneysel in vivo kurdu Döteryumlanmış su 14.1 T. Dış standart trimethylsilyl-propiyonik-2 ,2,3,3-d4 asit (TSP / D 2 O) canlı Drosophila soruşturma HRMAS 1H-MRS. HRMAS prob sihirli açıda rotor pozisyonu: kare.
Şekil 2 canlı Drosophila melanogaster wt sinek in vivo 1D HRMAS 1 H CPMG spektrumları. Lipid bileşenleri: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), asetat (Ac), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), (β-Ala) β-Alanin, Phosphocholin (PC) ve phophoetanolamine (PE), Gliserol (1,3-C 2 H 4.10, 4.30 ppm; 2-C H 5.22 ppm) C Y = C H (5.33 ppm).
Şekil 3 in vivo 2D 1H-1H 14.1 T. Küçük metabolitleri ve lipid bileşenleri canlı Drosophila melanogaster wt sinek TOBSY HRMAS spektrum tespit edildi. Metabolitlerinin: alanin (Ala), β-Alanin (β-Ala), arjinin (Arg), glutamin (Gln), glutamat (Glu), PC Phosphocholin (PC), phophoetanolamine (PE), Taurin (Tau), α-glikoz (α-YIK) ve gliserol. Lipidler bileşenleri: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C Y = C H (5.33 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son meyve in vivo MRG fizibilite raporu istisna ile 6 uçar, Drosophila in vivo MRS çalışmalarında henüz bildirilmiştir değil. İşbu Protokol, biyolojik olarak önemli moleküller tespit etmek için in vivo HRMAS 1 H-MRS yaklaşımı bir roman uygulanması açıklanmaktadır. Özellikle, biz sıfır sinek ölüm elde ederken, lipidler ve canlı Drosophila küçük metabolitleri yeterli edinimi süresi, yaklaşık 45 dakika, 14.1 T uçar tespit edildi . TOBSY rotor senkronize bir Wurst-8 adyabatik darbe (C9 1 15), önceki ile anlaşma, tatmin edici bir SNR ve göreceli doku spektrumları izotropik karıştırma darbe (MLEV 16) kullanmak için iyi bir çözünürlük elde etmek için bize izin raporları 3, 7. TOBSY kullanmak için geliştirilmiş bir metabolik profil Drosophila algılamak için yeteneğimiz TOBSY 1D CPMG kullanılan bu metabolit konsantrasyonları eşzamanlı kalitatif ve kantitatif analiz için uygun ve Drosophila metabolik disfonksiyonu daha iyi değerlendirilmesini sağlar göstermektedir .
Bizim yaklaşımımız roman Drosophila tahribatsız in vivo araştırma yaklaşımları geliştirilmesi, biyomedikal paradigmaların araştırmak ve böylece terapötik gelişme doğrudan biyobelirteçleri sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvancılık Araştırma İnceleme Kurulu Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma, Laurence G. Rahme Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe AI063433, Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika Müdürü Sağlık Ulusal Enstitüsü Enstitüleri (NIH) Merkezi Grant (P50GM021700) tarafından kısmen desteklenmiştir. Çocuklar araştırma bursu (8893) A. Aria Tzika NMR çekirdek) ve Shriner Hastanesi. Biz Dionyssios Mintzopoulos doktora teşekkür Bu protokol ve Ovidiu C. Andronesi doktora geliştirme ilk aşamalarında yardım için TOBSY darbe dizisi ile ilgili yardım için.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
