Summary
Эта технология позволяет использовать с высоким разрешением магическим углом спиннинг протона МР-спектроскопия (HRMAS 1H-MRS) для молекулярных характеристик живых
Abstract
Высокого разрешения магическим углом Спиннинг (HRMAS) протонной магнитно-резонансной спектроскопии (
Protocol
Часть 1: Подготовка дрозофилы для измерения HRMAS
- С помощью стандартных процедур flylab 1, собирают вновь eclosing мух в течение 3 дней и передачи им летать флаконах, содержащих свежие продукты летать. Инкубируйте собранных мух в течение 5 дней, чтобы мухи станут 5-8 дней непосредственно перед экспериментом. Только одного пола (обычно мужчины) используется для экспериментов.
- Используйте здоровые, неповрежденные дикого типа мухи сравнить с обработанными например, травмированные или генетически измененных мух 1.
- Место одного летит в 2 мл пробирки, содержащие часть (~ 0,2 мл) летучей пищи за 24 часов до эксперимента. Эти трубки медведя отверстие в трубке чашку с использованием пламени нагревают инсулина иглу.
- Взвесьте трубы непосредственно до и после вставки летать использованием высоких баланс точности и определить вес каждого летать с вычитанием первое значение из последнего. Одного мужчины летают весит обычно 0,7-1 мг.
Часть 2: Подготовка HRMAS ротора.
- Место одной трубки на льду в течение менее чем за минуту, чтобы обезболить летать внутри.
- Положите летать на слой алюминиевой фольги помещают на лед и нажмите летать мягко в полусферической полые пространства вставить ЯМР ротора с помощью мягкой щетки, чтобы обеспечить полное включение летать, избегая при этом летать травмы.
- Место вставить оксида циркония (ZrO 2) трубы ротора (4 мм в диаметре, 50 мкл), чтобы найти мухи между ротором вставки и нижней части ротора (см. рисунок 1).
- Закрыть вставка с винтом и покрыть ее парафильмом (см. рисунок 1), чтобы предотвратить контакт между летать и решение TSP стандарт (TSP: триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты, Mw = 172, δ = 0,00 промилле, 50 мм в дейтерированных водой D 2 O, которые функционируют в качестве ссылки для сдвига резонанса химического и количественного).
- Добавить 8 мкл TSP стандартное решение на верхней части ротора вставки. (См. рисунок 1).
- Безопасные и затянуть весь созданный в роторы с верхней крышке (см. рисунок 1).
Часть 3: HRMAS сбора данных
- Ввести ротора в зонд HRMAS и расположите его под магическим углом 54,7 ° (см. рисунок 1).
- Установите температуру на 4 ° С BTO-2000 блок в сочетании с единицы пневматического МАС. Мухи хранить при температуре 4 ° С в то время как в спектрометр для поддержания анестезии.
- Установить HRMAS 1 H МРС спиннинг ставка в 2 MAS кГц.
- Стабилизация частоты вращения MAS на 2,0 ± 0,001 кГц контроллер MAS скорость (частота вращения).
- Для магнит приготовления: настройка и соответствуют катушки для оптимальной производительности и прокладку магнитом для оптимального качества спектров.
- Приобретать одномерных 1 H спектров с использованием ротора синхронизированы Карр-Перселл-Мейбума-Гилл (CPMG) спиновое эхо последовательности импульсов 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) п приобретения], который работает как T 2 фильтра удалить уширения спектра ЯМР 1 Н одном лету спектров приобретенных одномерных данных по всем образцам. Синхронизация между задержки импульса (τ = 500μs) с частотой вращения MAS (2 кГц). Установить число переходных процессов при 256 с 32 768 (32k) точек данных. Приобретение время 9 мин.
- Приобретать двумерных (2D) 1 H-1 H ЯМР HRMAS одного лету спектры на всех образцах использованием TOBSY последовательность импульсов с адиабатическим 3. Приобретение параметрами являются: 2k точек данных прямого измерения (11 частей на миллион ширина спектра), 1 с водой предварительно насыщения в процессе релаксации задержки, 8 сканирований в прирост, 128 шагом, общее время повторения 2 сек, 45 мс, время перемешивания, и в общей сложности приобретением время 29 мин.
Часть 4: Обработка данных / Анализ
- Анализ образцов MRspectra использованием MestReC программное обеспечение (Mestrelab исследований, www.mestrec.com)
- Используйте уширения аподизации функцией 0,5 Гц и применяются ко всем HRMAS 1 H FIDS до преобразования Фурье.
- Ссылка спектров MR по отношению к TSP в δ = 0,0 промилле (внешний стандарт).
- Фазы спектров вручную и применять базовые оценки Уиттекер вычесть основных компонента базового до пика расчетами области.
- Оценка площадей пиков использованием MestReC программного обеспечения. Шкала высот пиков по отношению к TSP для каждого приобретенного спектра (TSP высота пика = 1). Использование Т-тестов (с двумя хвостами, р <0,05), для сравнения в группе, чтобы между-групп коэффициентов.
- 2D параметры TOBSY процесса являются: QSINE = 2 функция окна в обоих измерениях, FT с 2k точек в прямом измерении и нулевой наполнения 1k во втором измерении, фазовую коррекцию в обоих направлениях и коррекция базовой линии во втором измерении.
- Продукция 2D-спектров с использованием программы Спарки (TD Годдарда и Д. Г. Неллер, SPARKY 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/Главная / Sparky /)
Часть 5: Представитель спектры от игрового мухи дрозофилы
Процедур, описанных выше разрешение собирать воспроизводимых спектров от живых мух Drosophila MELANOGASTER. На рисунках 2 и 3 показаны спектры представитель MR, приобретенных в дикого типа (WT) Орегон-R мух. На рисунке 2 представлены 1D 1 H HRMAS CPMG спектров. Основные компоненты липидного [C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле)], глицерина (1,3-C H 4,10 промилле и 4,30 промилле; 2-CH 2 5,24 промилле), и малых метаболитов: β-аланина (β-Ala , 2,57 промилле), ацетат (Ас, 1,97 промилле), фосфохолин (PC, 3,22 промилле) и phophoetanolamine (ПЭ, 3.23ppm) были обнаружены и присваивается в соответствии с предыдущих докладах 4, 5. Сигналы на 2,02 промилле были назначены на метиленовых протонов C H2-CH = CH фрагмент моно-ненасыщенных жирных кислот (т.е. пальмитолеиновой). Ненасыщенных кислот были определены сигнала на 5,33 промилле производства протонов-CH = CH-группу. Малый метаболиты, которые не могут быть назначены или не были видны использованием 1D спектра были обнаружены с помощью 2D-1 Н-1 Н TOBSY HRMAS (см. рисунок 3).
Рисунок 1. Экспериментальная настройка в естественных условиях HRMAS 1H MRS для исследования живых дрозофил на 14,1 Т. Внешний стандарт триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты в дейтерированных воды (TSP / D 2 O). На площади: положение ротора под магическим углом в HRMAS зонда.
Рисунок 2. В естественных условиях 1D HRMAS 1 H CPMG спектры жить дрозофилы летать MELANOGASTER вес. Липидных компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), ацетат (Ас), С H 2 C = C (2,02 промилле), C H 2 C = O (2,24 промилле), β-аланина (β-Ala), фосфохолин (ПК) и phophoetanolamine (PE), глицерин (1,3-C H 4,10, 4,30 промилле; 2-C 2 H 5,22 промилле) , C H = C H (5,33 промилле).
Рисунок 3. В естественных условиях 2D 1H-1H TOBSY HRMAS спектр жить дрозофилы вес летать на 14,1 Т. Малый метаболитов и липидных компонентов были определены. Метаболиты: аланин (Ala), β-аланина (β-Ala), аргинина (Arg), глютамин (Gln), глутамата (Glu), ПК фосфохолин (ПК), phophoetanolamine (PE), таурин (Тау), α-глюкозы (α-GLC) и глицерин. Липиды компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1,58 промилле), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За исключением последнего доклада возможности в естественных условиях МРТ у плодовых мушек 6, в естественных условиях MRS исследования у дрозофилы до сих пор не сообщалось. В настоящее время протокол, мы описываем реализацию романа в естественных условиях HRMAS 1 H-MRS подход для выявления биологически важных молекул. В частности, мы обнаружили липидов и малых метаболитов в живых мухи дрозофилы составляет 14,1 т в примерно 45 мин, что позволяет достаточно времени приобретения, при достижении нулевой смертности летать. Использование роторно-синхронизированы Wurst-8 адиабатического импульса (C9 1 15) в TOBSY позволил получить удовлетворительных SNR и хорошим разрешением ткани спектров по сравнению с использованием изотропного смешивания импульса (MLEV-16), в соответствии с предыдущими докладов 3, 7. Наша способность использовать TOBSY обнаружить улучшение метаболического профиля показывает, что дрозофилы TOBSY использоваться с 1D CPMG хорошо подходит для одновременного качественного и количественного анализа концентрации метаболитов и позволяет улучшить оценки метаболической дисфункции у дрозофилы.
Наш подход предлагает биомаркеров для расследования биомедицинской парадигмы при продвижении развития романа в естественных условиях неразрушающего исследовательских подходов у дрозофилы, и таким образом может направить новые терапевтические развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Massachusetts General Hospital Институциональный комитет Исследования животных Review Board.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять AI063433 к Лоуренс Г. Rahme, Национального института Институтов Здоровья (NIH) Центр Грант (P50GM021700) Рональда Г. Томпкинс (А. Ария Tzika, директор основные ЯМР), и больница Шрайнер по делам детей исследовательского гранта (# 8893) А. Ария Tzika. Мы благодарим Dionyssios Mintzopoulos кандидат за помощь в начальные фазы развития этого протокола и Овидиу С. Andronesi кандидат за помощь в TOBSY импульсной последовательности.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
