Summary
Esta técnica permite el uso de ángulo mágico de alta resolución girar espectroscopia de resonancia magnética (HRMAS 1H-MRS) para la caracterización molecular de vivir
Abstract
De alta resolución Magic Angle Spinning (HRMAS) espectroscopia de resonancia magnética de protones (
Protocol
Parte 1: Preparación para las mediciones de Drosophila HRMAS
- Utilizando procedimientos estándar flylab 1, recoger nuevas eclosing vuela por 3 días y la transferencia a volar viales que contienen los alimentos frescos volar. Incubar las moscas recogidas por 5 días para que las moscas se convertirán en 5-8 días de edad, justo antes del experimento. Un solo sexo (por lo general hombres) se utiliza para los experimentos.
- Uso saludable, de tipo salvaje intacta vuela a comparar con el tratado, por ejemplo, traumatizados o alterados genéticamente moscas 1.
- Lugar vuela solo en tubos de 2 ml que contiene un trozo (~ 0,2 ml) de la mosca de los alimentos 24 horas antes del experimento. Estos tubos tienen un agujero en la copa de tubo hecho con una aguja de insulina de la llama calienta.
- Pesar los tubos inmediatamente antes y después de la inserción de volar con una balanza de alta precisión y definir el peso de cada vuelo s restando el primer valor de este último. Una mosca macho pesa generalmente 0,7-1 mg.
Parte 2: Preparación HRMAS Rotor.
- Coloque un solo tubo en hielo durante menos de un minuto para anestesiar el interior volar.
- Poner la mosca en una capa de papel de aluminio colocado en hielo y empuje de la mosca suavemente en el espacio semiesférico hueco de la pieza del rotor de RMN con un cepillo suave para asegurar una inserción completa volar evitando lesiones volar.
- Coloque el inserto en el óxido de zirconio (ZrO 2) del tubo del rotor (4 mm de diámetro, 50 l) para localizar las moscas entre el inserto de rotor y la parte inferior del rotor (ver figura 1).
- Cerca de la inserción de un tornillo y se cubre con parafina (ver figura 1) para evitar el contacto entre la mosca y la solución de TSP estándar (TSP: trimetilsilil-propiónico-2 ,2,3,3-d4 ácido, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 mM en agua deuterado-D O 2, que funcionan como una referencia tanto para los desplazamientos químicos de resonancia y cuantificación).
- Añadir 8 l de solución de TSP de serie en la parte superior de la pieza del rotor. (Ver figura 1).
- Seguro y apretar el instituido por los rotores con una tapa superior (ver figura 1).
Parte 3: HRMAS Adquisición de Datos
- Introducir el rotor en la sonda HRMAS y colóquelo en el ángulo mágico 54,7 ° (ver figura 1).
- Ajuste la temperatura a 4 ° C por una unidad de BTO-2000 en combinación con la unidad neumática MAS. Las moscas se mantienen a 4 ° C, mientras que en el espectrómetro para mantener la anestesia.
- Establecer el HRMAS una tasa de H MRS girando a dos MAS kHz.
- Estabilizar la frecuencia de rotación del MAS en el 2,0 ± 0.001 kHz por un controlador de velocidad MAS (frecuencia de rotación).
- Para la preparación de imán: sintonía y que coincida con la bobina para un rendimiento óptimo y calza el imán para una calidad óptima de los espectros.
- Adquirir una dimensión un espectro de H con rotor sincronizado Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin echo secuencia de pulsos 2, [90 ° - (τ-180 º - τ) n-adquisición], que funciona como un filtro para T 2 eliminar el ensanchamiento espectral 1 H RMN de una sola mosca de espectros para adquirir una dimensión de datos en todas las muestras. Sincronizar el retardo entre pulsos (τ = 500μs) a la frecuencia de rotación MAS (2 kHz). Establecer el número de transitorios a 256, con 32.768 (32K) puntos de datos. Tiempo de adquisición de 9 min.
- La adquisición de dos dimensiones (2D) 1 H-1 H RMN HRMAS solo vuelan los espectros de todas las muestras usando una secuencia de pulsos adiabáticos TOBSY con 3. Parámetros de adquisición son: dimensión 2k puntos de datos directos (11 ppm ancho espectral), el agua 1 s antes de la saturación durante el tiempo de relajación, 8 lecturas por el incremento de 128 aumentos, el tiempo de la repetición total de 2 s, 45 ms de tiempo de mezcla, y un total de adquisición tiempo de 29 min.
Parte 4: Tratamiento de datos / Análisis
- Analizar el MRspectra de especímenes con MestReC software (Mestrelab Investigación, www.mestrec.com)
- Utilice una línea de ampliar la función de apodización de 0,5 Hz y se aplican a todos los HRMAS un FID H antes de la transformación de Fourier.
- Referencia de los espectros de RM con respecto a TSP a δ = 0.0 ppm (estándar externo).
- Fase de espectros y aplicar manualmente un estimador de referencia Whittaker para restar los componentes de gama de la línea de base antes de que los cálculos del área del pico.
- Estimar las áreas de pico utilizando software MestReC. Escala de alturas de los picos con respecto a TSP para cada espectro adquirido (TSP altura del pico = 1). Utilice la prueba t (dos colas, p <0,05) para comparar dentro del grupo de relaciones entre grupos.
- 2D parámetros del proceso TOBSY son: QSINE = 2 la función ventana en ambas dimensiones, FT, con puntos de 2k en la dimensión directa y cero para el llenado de 1k en la segunda dimensión, la corrección de fase en las dos dimensiones y la corrección de línea de base en la segunda dimensión.
- Producir los espectros 2D con Sparky programa (TD Goddard y Kneller DG, Sparky 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/Inicio / sparky /)
Parte 5: Espectros Representante de Live moscas Drosophila melanogaster
Los procedimientos descritos anteriormente permiten recoger espectros reproducibles de moscas Drosophila melanogaster vivir. Figuras 2 y 3 muestran representante MR espectros adquiridos de tipo salvaje (wt) de Oregon-R moscas. La figura 2 presenta 1D 1 H HRMAS espectros CPMG. Los principales componentes lípidos [C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (ppm 1,33), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm)], el glicerol (1,3-C H 4,10 ppm y 4,30 ppm, 2-CH 2 5.24 ppm), y pequeños metabolitos: β-alanina (β-Ala , 2,57 ppm), el acetato (Ac 1,97 ppm), fosfocolina (PC, 3,22 ppm) y phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) fueron detectados y clasificados de acuerdo con informes anteriores 4, 5. Señales a 2.02 ppm fueron asignados a los protones de metileno de la C H2-CH = CH mitad de los mono-ácidos grasos insaturados (palmitoleico es decir). Los ácidos grasos insaturados fueron identificados por una señal a 5,33 ppm producido por protones de la-CH = CH-fracción. Metabolitos pequeños que no pueden ser asignados o no visible en el espectro 1D fueron detectados utilizando 2D 1 H-1 H TOBSY HRMAS (ver figura 3).
Figura 1. Experimental puesta en marcha de in vivo HRMAS 1H MRS para la investigación de Drosophila en vivo en el 14,1 T. externo estándar trimetilsilil-propiónico-2 ,2,3,3-d4 ácido en el agua deuterado (TSP / D 2 O). En la plaza: la posición del rotor en el ángulo mágico en HRMAS sonda.
Figura 2. 1D En vivo HRMAS espectros de 1 H CPMG de vivir en peso mosca Drosophila melanogaster. Componentes lipídicos: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (ppm 1,33), C H 2 C-CO (1.58ppm), acetato (Ac), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), β-alanina (β-Ala), fosfocolina (PC) y phophoetanolamine (PE), glicerol (1,3-C H 4,10, 4,30 ppm; 2-C H 2 5,22 ppm) , C = C H H (5,33 ppm).
Figura 3. In vivo 2D 1H-1H TOBSY espectro HRMAS de vivir en peso mosca Drosophila melanogaster en el 14,1 metabolitos T. pequeñas y componentes lipídicos fueron identificados. Metabolitos: alanina (Ala), β-alanina (β-Ala), arginina (Arg), glutamina (Gln), el glutamato (Glu), fosfocolina PC (PC), phophoetanolamine (PE), taurina (Tau), α-glucosa (α-Glc) y glicerol. Lípidos componentes: C H 3 (0,89 ppm), (C H 2) n (ppm 1,33), C H 2 C-CO (1,58 ppm), C H 2 C = C (2,02 ppm), C H 2 C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm).
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Discussion
Con la excepción del reciente informe de la viabilidad de la resonancia magnética in vivo en moscas de la fruta 6, los estudios in vivo MRS en Drosophila aún no han sido reportados. En el presente Protocolo, se describe la implementación de una novela en vivo HRMAS 1 H-MRS enfoque para la detección de moléculas biológicamente importantes. En concreto, se detectaron metabolitos de los lípidos y los pequeños viven en moscas Drosophila en el 14,1 T en aproximadamente 45 minutos, lo que permite el tiempo de adquisición adecuadas, mientras que el logro de mortalidad de las moscas cero. El uso de un rotor sincronizado Wurst-8 pulsos adiabáticos (C9 1 15) en TOBSY nos ha permitido obtener una satisfactoria SNR y una buena resolución de los espectros de los tejidos en relación con el uso de un pulso isotrópico mezcla (MLEV-16), de acuerdo con las anteriores informes 3, 7. Nuestra capacidad de utilizar TOBSY para detectar un mejor perfil metabólico de Drosophila parece indicar que se utiliza con TOBSY CPMG 1D es muy adecuado para cualitativa simultánea y el análisis cuantitativo de las concentraciones de metabolitos y permite una mejor evaluación de la disfunción metabólica en Drosophila.
Nuestro enfoque ofrece biomarcadores para investigar los paradigmas biomédicos mientras se avanza en el desarrollo de nuevos enfoques de la investigación in vivo no destructivos en la Drosophila, por lo que pueden orientar el desarrollo de terapéuticas novedosas.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Massachusetts General Hospital de Investigación Institucional Animal Comité de Revisión de la Junta.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) otorgar AI063433 a Laurence G. Rahme, de los Institutos Nacional de Salud (NIH) Centro de Donación (P50GM021700) a Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, Director de el núcleo de RMN), y el Hospital Shriner una beca de investigación para la Infancia (# 8893) para A. Aria Tzika. Damos las gracias a Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. de asistencia en las fases iniciales del desarrollo de este protocolo y Ovidiu C. Andronesi Ph.D. para obtener ayuda con la secuencia de pulsos TOBSY.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Deuterium oxide | Reagent | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| agar, sucrose, yeast, cornmeal | Food | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS or Canton-S flies | Adult fly lines | Bloomington Stock center | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| Paintbrush | Equipment | (size 0) | ||
| 2ml tubes | Equipment | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Fly incubators | Equipment | high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle. | ||
| Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe | Equipment | Bruker Corporation | ||
| BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit | Equipment | Bruker Corporation | ||
| 4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul) | Equipment | Bruker Corporation | B3829 (Bruker store) | |
| MestReC (Mestrelab Research) | Software | 1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/ |
||
| SPARKY 3, USCF | Software | 2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
References
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
