Summary
Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.
Abstract
Ein detailliertes Protokoll zur Kristallisation von Membranproteinen durch Lipid-Mesophasen beschrieben. Diese Methode hat verschiedentlich schon als Lipid-kubischen Phase oder in meso-Methode bezeichnet. Die Methode hat sich gezeigt, dass sehr vielseitig, dass es verwendet wurde, um röntgenkristallographische Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Proteine, Eiweiße, monomere, Homo-und Hetero-Multimere, chromophorhaltige und Chromophor-frei sind zu lösen, und alpha -Helix und beta-barrel-Proteine. Jüngste Erfolge mit in meso Kristallisation sind die Menschen entwickelt, beta2-adrenerge und Adenosin A2a G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Protokolle sind für die Wiederherstellung der Membranprotein in den Monoolein-basierte Mesophase, und für den Aufbau Kristallisationen in den manuellen Modus vorgestellt. Weitere Schritte in den gesamten Prozess, wie Kristall-Ernte werden in Zukunft Video-Artikel angesprochen werden. Die benötigte Zeit, um das Protein-beladenen Mesophase vorzubereiten und die Einrichtung einer Kristallisation Platte manuell über eine Stunde.
Protocol
Ein wichtiger Schwerpunkt im Bereich der strukturellen und funktionellen Biologie ist die biologische Membran (Abbildung 1). Die Membran, die die Zelle und subzelluläre Organellen, wenn vorhanden umgibt, ist eine molekular dünne Struktur nur zwei Lipid-Moleküle auf und ist mit Proteinen besetzt. Struktur und Funktion zu beiden Lipid-und Protein aufgetragen sind von Interesse. Allerdings ist der Schwerpunkt dieses Artikels an Membranproteinen beschränkt.
Ein besseres Verständnis davon, wie Membranproteine Funktion auf molekularer Ebene ist aus zwei Gründen gesucht. Erstens gibt es die intellektuelle Befriedigung zu wissen, wie sie funktionieren. Zweitens, durch das Wissen, wie ein Protein funktioniert, gibt es immer die Aussicht, zu beheben, sollte es zu Fehlfunktionen oder zu verbessern oder sogar zu modifizieren für bestimmte Anwendungen. Drug-Design ist eine offensichtliche Ergebnis dieser Art von Arbeit. Ein Ansatz, um herauszufinden, wie ein Membranprotein auf molekularer Ebene funktioniert, ist, seine Struktur zu bestimmen. Dies beinhaltet die Gründung der Lage im 3-dimensionalen Raum aller Atome, oder zumindest alle Nicht-Wasserstoff-Atome, aus denen sich das Protein. Die Methode, die wir verwenden für diesen Zweck ist makromolekulare Röntgenkristallographie (MX). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Membranprotein, dessen Struktur wurde anhand von MX. Eine Beugung Qualität Kristalle des Proteins erforderlich ist, um MX zu tun.
Natürlich gibt es viele Schritte in die Strukturbestimmung mittels makromolekulare Kristallographie beteiligt. Dies ist in Abbildung 3 dargestellt. Typischerweise enthalten diese Identifizierung ein Membranprotein Ziel, und dann produziert, gereinigt und kristallisiert es. Diffraction Messungen werden auf den Kristall mit einem Heim-oder einem Synchrotron-Röntgenquelle durchgeführt. Die Beugung Daten verarbeitet werden, wodurch sich ein Elektronendichte, die dann mit ein molekulares Modell ausgestattet ist. Das Modell, wenn raffiniert, können verwendet werden, um die Wirkungsweise des Proteins zu erforschen und für die Struktur-based drug design.
Der Schwerpunkt dieses Artikels ist zu zeigen, wie wir Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen mit Lipid-Mesophasen zu produzieren, die in meso-Methode sogenannten. Eine aktuelle Überprüfung des Verfahrens und sein Anwendungsbereich ist in Referenz 1 (Caffrey, 2009). Die Schritt-für-Schritt-Protokoll haben wir hier folgen wird, ist in Referenz 2 (Caffrey und Cherezov, 2009) beschrieben.
Ein Flussdiagramm fasst die Schritte in und Zeit für den Aufbau eines in meso Membranprotein Kristallisation Studie erforderlich wird, ist in Abbildung 4 dargestellt. Dieser Artikel behandelt die Schritte durch gestrichelte rote Linien umschlossen.
Teil 1: Vorbereiten der Kristallisation Plates
- Position eines silanisierten Objektträger auf der Werkbank.
- Entfernen Sie die Schutzfolie abdecken, von einer Oberfläche aus einem Streifen aus gelochten Doppel-Stick Abstandshalter (im Handel erhältlich, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und unten).
- Legen Sie das Band, klebrigen Seite nach unten in Kontakt mit der Oberfläche der Folie.
- Pressure-Siegel des Bandes, um die Folie mit einem Brayer oder Rolle. Aluminiumfolie kann zwischen dem Band und der Walze auf der Basis der Brunnen zu schützen platziert werden.
- Entfernen Sie die zweite Papier Abdeckung von der Band auf ihrer oberen klebrige Oberfläche freizulegen.
- Legen Sie individuelle silanisiert Deckgläser in unmittelbarer Nähe zu der Platte für die schnelle und effiziente Abdichtung von Brunnen, sobald der Ladevorgang abgeschlossen ist.
Teil 2: Vorbereiten des Lipid Spritze
- Legen Sie die Lipid (oft Monoolein) in einem temperierten Block bei 45 ° C für 3 Minuten um es geschmolzen.
- Während die Lipid schmilzt vorzubereiten zwei 100-ul gasdichten Hamilton-Spritzen für den Einsatz in der Lipid-Protein-Mischschritt. Entfernen Sie die Teflon Zwinge aus der Spritze, dass die Protein-Lösung enthält. Legen Sie die Spritze, dass die Lipid-halten wird daneben (Verlassen ihrer Hülse in place).
- Verbinden Sie die Kupplung (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte unterhalb und Referenz 3 (Cheng et al., 1998)) an das Lipid Spritze. Handfest anziehen Koppler mit der Spritze, aber nicht zu fest anziehen. Entfernen Sie den Kolben aus dem Lauf der Lipid-Spritze.
- Beachten Sie, dass die Lipid muss geschmolzenen bevor Sie fortfahren. Setzen Sie die Pipette auf 30 ul und langsam nehmen etwa 30 ul des geschmolzenen Lipids. Langsam liefern, wie viel von dem geschmolzenen Lipid, wie Sie können in das offene Ende der Spritze dabei nicht um Luftspalte einzuführen.
- Setzen Sie die Kolben in den Zylinder in Kontakt mit dem geschmolzenen Lipid-und langsam voran den Kolben bis das Fass mit der Spritze senkrecht gehalten wie in dem Video gezeigt. Luftblasen, die versehentlich gefangen werden können, sollten in den Prozess steigen und freigegeben werden.
- Sorgfältig bestimmen das Volumen des Lipid in der Spritze durch das Lesen der Markierungen auf der Spritze.
- Schieben Sie die ferrmodul auf die Nadel sich von der Kupplung. Verwenden Sie den Kolben, um das geschmolzene Lipid bis das Fass und langsam und behutsam in die Nadel in den Mittelpunkt des Kopplers Kraft.
Teil 3: Vorbereitung der Protein Spritze
- Die Protein-Lösung sollte bei 14.000 g für 5 bis 10 Minuten bei 4 ° C gesponnen, um große Aggregate vor der Einrichtung Kristallisation Studien zu entfernen. Entfernen Sie die Protein-Lösung aus dem Eis und lassen Sie es bei Raumtemperatur äquilibriert.
- Berechnen Sie das Volumen der Proteinlösung zu verwenden, um die kubische Phase bei Form oder fast voll Feuchtigkeit. Für Monoolein bei 20 ° C, volle Hydratation mit Wasser tritt bei knapp 40% Wasser (Masse) wie im Phasendiagramm 5 (Abbildung 5).
- Mit einer 25 oder 50 ul Hamilton-Spritze nehmen die benötigte Menge an Protein-Lösung. Übertragen Sie die Lösung auf die Teflon Spitze des Kolbens im Zylinder des Proteins Spritze kümmern, um Luftblasen zu vermeiden.
- Vorsichtig ziehen Sie die Nadel und messen das Volumen der Proteinlösung in die Spritze. Es sollte dem Wert entsprechen, der im vorherigen Schritt geliefert.
- Langsam Zoll die Protein-Lösung bis das Fass, um am Ende bündig mit seinem offenen Ende.
- Schrauben Sie die Spritze Protein in das offene Ende des Kopplers an der Lipid-Spritze. Es ist wichtig, dass das Gerät nicht übermäßig angezogen werden. Zu festes Anziehen der versammelten Mischvorrichtung in dieser Phase führt zur Beschädigung der Ferrulen und führen zu Undichtigkeiten. Under-Verschärfung wird auch undicht führen.
Teil 4: Mischen Protein-Lösung und Lipid: Making the Mesophase
- Um Wirkung Mischen, vorher den Kolben auf die Protein-Seite des montierten Rührwerk an seine Grenzen, mit dem Daumen oder Zeigefinger fahren die Protein-Lösung aus dem Protein Spritze, durch den Koppler und in die Lipid-Spritze.
- Der Kolben auf den Lipid-Seite wird nun verwendet, um den Inhalt der Lipid-Spritze wieder Fahrt durch den Koppler und in das Protein Spritze.
- Der Prozess wird mehrmals wiederholt, gelegentlich hundert Stellen oder mehr erforderlich sind, um eine homogene Mesophase zu erzeugen. Zu Beginn der Vermischung, die Bewegung von Material hin und her durch den Koppler kann uneben und manchmal ist zusätzliche Kraft benötigt, um Wirkung Vermischung. Initial Mischen ist in der Regel durch die Entwicklung einer uneinheitlichen Trübung in der Probe begleitet. Als Homogenisierung weiterkommt, wird die Textur einheitlich und charakteristisch für die viskosen kubische Phase, wie auch das optische Erscheinungsbild der aufstrebenden kubische Mesophase.
- Wenn die Bedingungen angemessen und die kubische Phase bildet, sollte die Dispersion erscheinen optisch transparent in die Spritze. Daher sollten die Markierungen auf der Spritze gut lesbar durch die Mesophase in den Lauf.
- Sehr leichte Abkühlung der Probe während der Mischung, indem Sie die Spritze Mischer für eine kurze Zeit auf Eis beschleunigen kann Homogenisierung und der Erreichung der Transparenz. Allerdings ist es wichtig, nicht auf die Probe overcool.
- Es ist darauf zu vermeiden, sehr kräftiges Mischen werden, da dies kann dazu führen, Probentemperatur steigt durch Reibungswärme Heizung 3.
Teil 5: Das Laden der Dispenser
- Entfernen Sie die Nadel und der Kolben aus einer 10-ul Hamilton-Spritze. Verlassen Sie die Teflon Klemmring statt.
- Entfernen Sie die Überwurfmutter aus dem Spender mit Hilfe einer kleinen Münze.
- Mit der Ratsche Arm vollständig zurückgezogen, legen Sie die Spritze - ohne Kolben und Nadel - durch den Haltering des Spenders.
- Ersetzen Sie die Überwurfmutter, Dichtung zugewandte Seite der Spritze, und schrauben Sie ihn in dicht am offenen Ende der Spritze.
Es sollte darauf geachtet werden, die Spritze richtig im Haltering und dass der Lauf ist parallel mit der Ratsche Arm zentriert werden. Beide können mit bloßem Auge beurteilt werden. Diese beiden Anforderungen sind entscheidend, um ein Auslaufen zu vermeiden. - Pass des Kolbens durch die Greif-Ring mit dem Greifer Mutter abgeschraubt ein paar Umdrehungen und führen Sie den Kolben in das offene Ende der Spritze. Drücken Sie die Ratsche Arm voll. Bewegen Sie den Kolben in den Lauf und überprüfen Sie, dass es frei und wahr reist in den Lauf. Es kann helfen, die Schraube an der Führungsschiene lösen, um den Kolben frei bewegen zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass es funktioniert. Drücken Sie den Kolben bis zur Teflon Spitze deckt sich mit der Null-ul Teilstrich auf dem Lauf. Wenn die Schraube an der Führungsschiene gelockert wurde, ziehen Sie es und überprüfen Sie, dass der Kolben frei bewegt.
- Bewegen Sie den Kolben auf der einen Seite der versammelten Mischanlage zur Null-ul Teilstrich der Mesophase zu den anderen Spritze und den Koppler übertragen.
- Trennen Sie die leere Spritze (mit Aderendhülse in place) von der Mischanlage und sofort eine Verbindung der geladenen Spritze - mit dem Koppler einettached - die Gewinde Beendigung des 10-ul Dosierspritze. Der Grad der Dichtigkeit, mit der Kupplung geschieht, ist entscheidend, wie bereits erwähnt.
- Laden Sie die Dosierspritze durch Drücken Sie den Kolben der 100-ul Spritze so, dass die Mesophase Transfers durch den Koppler.
- Sichern Sie sich eine kurze, flache Spitze Nadel auf den Stahl Beendigung der Dosierspritze und vorsichtig ziehen Sie sie fest.
- Spannen Sie den Kolben, um die Ratsche Arm durch Anziehen der Mutter in die Zahnscheibe. Es sollte darauf geachtet, nicht über-die Mutter anziehen, da dies Partitur und verformen den Kolben macht sie unbrauchbar werden. Es ist wichtig, dass die Reise Angebot bereitgestellt, um die Ratsche Arm im gespannten Zustand nicht mehr als einen Zentimeter, wie im Video gezeigt, begrenzt werden. Darüber hinaus wird der Kolben haben eine Tendenz, Schnalle und Lieferung kann scheitern.
- Drücken Sie die Ratsche Trommel mehrmals, um die Kolben in den Lauf vor, und füllt das Hohlraumvolumen der Nadel und dem Laden der Nadel. Dieser Schritt sollte wiederholt werden (bis zu zehn Mal), bis eine kontinuierliche Kette von der Mesophase ergibt sich aus der Spitze der Nadel werden.
- Kristallisation Studien sollten sofort beginnen, da einige Proteine instabil in der kubischen Phase ohne Zusatz von Fällungsmittel sind.
Teil 6: Einrichten Kristallisation Plates
- Legen Sie ein Multi-Well-Platte Kristallisation und Deckglas auf einer Fläche erhöht ein paar Zentimeter über der Werkbank für eine einfache Beladung. Optimal Kontrast und bessere Sichtbarkeit erreicht werden, wenn die Oberfläche ist etwas dunkel.
- Homogenisieren Fällungsmittel Lösungen und uncap die Fläschchen. Stellen Sie die Fällungsmittel Verzicht Pipette 1 ul.
- Mit der Dosierspritze vertikal in einer Hand gehalten, verwenden Sie die freie Hand, um die Nadelspitze in der Mitte und direkt oberhalb der Basis der auch die Nummer 1 Position. Drücken Sie die Taste auf der Repetierpipette zu einem Bolus von Mesophase auf die Glasoberfläche zu vertreiben. Das Bolusvolumen ist 200 nL, wenn die Standard-Repetierpipette mit einem 10-ul Spritze verwendet wird. Die Spitze der Nadel sollte nicht mehr als ein paar hundert Mikrometer über dem Basiszinssatz der gut sein, um eine ordnungsgemäße Lieferung zu gewährleisten.
- Nach 4 benachbarten Vertiefungen sind mit Mesophase, Platz 1 ul Fällungslösung übereinander Mesophase Bolus mit einem 2-ul-Pipette und Standard-Einweg-Tips geladen.
- So schnell wie möglich, legen Sie ein Deckglas direkt über die gefüllten Brunnen, um sie gleichmäßig zu bedecken. Zur Durchführung einer Wasser-Dichtheit, verwenden Sie einen Spachtel, um Druck auf das Deckglas, wo es in Kontakt mit den freiliegenden klebrigen Oberfläche der Abstandshalter gelten.
- Die Mesophase und Fällungsmittel Verzicht Vorgang kann wiederholt werden, bis alle Vertiefungen auf der Platte geladen werden und versiegelt werden.
- Beschriften Sie die Platte eindeutig für Tracking-Zwecke. Lichtempfindliche Proteine sind in der Regel durch das Einwickeln der Platten in Alu-Folie, bevor Sie sie in der Inkubationskammer behandelt.
- Legen Sie die Platten in einer temperierten Kammer, in der Regel bei 20 ° C.
- In regelmäßigen Abständen, inspizieren die Brunnen für das Kristallwachstum mit einem Polarisationsmikroskop mit einem 10 oder 20-fach Objektiv. Der Zeitplan in Labor des Autors verwendet wird, wie folgt: Tag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 und 60 post-setup. Überprüfen Sie sorgfältig die Mesophase Bolus Einstellung der Tiefenschärfe im 0,14-mm-dicke Probe. Die Untersuchung sollte sowohl in normalem Licht und zwischen gekreuzten Polarisatoren durchgeführt werden.
Teil 7: Repräsentative Ergebnisse
Das Aussehen der entstandenen Kristalle werden mit der Eigenfarbe des Membranproteins variieren, die Polarisation des Lichtes für die Inspektion (oder deren Fehlen) und die Art und Qualität der Beleuchtung verwendet. Abbildung 6 zeigt mehrere mögliche Kristall Auftritte. Natürlich farbige Membranproteine wachsenden in meso, wenn sie mit normalem Licht betrachtet werden können, wie sie in Abbildung 6 (Panels b und d) aussehen. Farblose Membranprotein Kristalle wachsen in der kubischen Phase, wenn sie mit normalem Licht betrachtet werden können, wie sie in Abbildung 6 (Systemsteuerung e) aussehen. Schließlich können farblose Membran-Protein-Kristalle wachsen in meso, wenn sie mit polarisiertem Licht betrachtet, wie in Abbildung 6 (Abb. A und C) zu suchen.
Die nächsten Schritte in den Gesamtprozess der Strukturbestimmung sind bis zur Ernte und Kryo-Kühlung der Kristalle und die Erfassung und Auswertung Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE Artikel abgedeckt werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung einer biologischen Membran, welche die Lipid-Doppelschicht in und auf denen es eine Vielzahl von Proteinen entfernt.
Abbildung 2. Die Strukturder Vitamin-B 12 Transport-Protein, BtuB, gelöst mit MX und Kristalle durch die in meso-Methode 6 in diesem Artikel dargestellt JoVE gewachsen.
Abbildung 3. Die Struktur-Funktions-Zyklus zeigt viele der Schritte bei der Beschaffung und Nutzung von vollständigen Informationen über die Struktur eines Proteins beteiligt.
Abbildung 4. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung von Membran-Protein-Kristalle von der in meso-Methode einbezogen. Nur die Schritte durch die gestrichelte rote Linie umgeben sind in diesem JoVE Artikel behandelt. Von Reference 2.
Abbildung 5. Eine vereinfachte Temperatur-Zusammensetzung Phasendiagramm für die Lipid-(Monoolein) / Wasser-System. Kristallisation Studien sind bis auf 20 ° C, wo die Lipid mit Wasser gesättigt bei 40% Feuchtigkeit. Die detaillierte Phasendiagramm ist in Referenz 5 zur Verfügung.
Abbildung 6. Kristalle von Membranproteinen wächst in der Lipid-Mesophase.
(A) Vitamin B 12 den Transport von Proteinen, BtuB 6, (b) Lichtsammelkomplex II 7, (c) das Adhäsin / Invasin OpcA 8, (d) Bakteriorhodopsin 9, (e) ein Kohlenhydrat-Transporter von Pseudomonas. Bilder, die mit normalem Licht (b, d, e) und zwischen gekreuzten Polarisatoren (a, c) aufgezeichnet.
Discussion
Die kubische Phase ist eine heikle und dynamisches Umfeld, das drastisch ändern kann mit der Änderung einer Reihe von Variablen. Es ist nicht möglich, eine Beschreibung der Einrichtung in meso Kristallisation Studien in den manuellen Modus, dass alle potentiellen Fallstricke beschreibt geben. Allerdings können viele Schwierigkeiten durch das Praktizieren der Technik, bevor es zu teuren Protein-Lösungen und durch Mäßigung in Druck, der auf Spritzen beim Mischen vermieden werden. Richtig gemacht, die in meso-Methode kann Kristalle von einer Vielzahl von Proteinen liefern, ist deren Zahl steigt ständig.
Die Beschreibung hier der Aufbau in meso Kristallisation Studien stützen sich auf den manuellen Modus fokussiert. Der Prozess kann, und oft wird geändert, um automatisierte Setup der Kristallisation Platten in diesen Fällen, dass gross angelegte Screening-Kristallisation erfordern erleichtern.
Acknowledgments
Es gibt viele, die zu dieser Arbeit beigetragen und die meisten sind aus dem Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group, in Vergangenheit und Gegenwart Mitgliedern. Um alle erweitern wir unsere wärmsten Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), der National Institutes of Health (GM75915) und der University of Limerick unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein solution | Reagent | Various | Various | |
| Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma-Aldrich | Various | |
| Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
| Purified water | Reagent | EMD Millipore | ||
| Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
| Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
| Gas-tight syringes | Tool | Hamilton Co | 80265 (25-µl) | |
| Syringe tips | Tool | Hamilton Co | 7770-020 (gauge 22) | |
| Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton Co | various/EBS-LCP-2 | |
| Repeating dispenser | Tool | Hamilton Co | 83700 | |
| Silanized glass microscope slides | Disposable | Gold Seal | 3010 | |
| microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
| Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
| Tweezers | Tool | Various | NA | |
| Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
| Chipped ice | Temperature Control | N/A | NA | |
| Tissues | Disposable | N/A | NA | |
| Calculator | Tool | Various | NA | |
| Lab notebook | Tool | Various | NA | |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3. |
||||
References
- Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
- Cherezov, V. In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution. J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).
- Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
- Cherezov, V. In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin. Proteins. 71, 24-34 (2008).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).
