使用油脂介孔结构的测定结晶膜蛋白

Summary

此处所描述的卡弗里膜的结构与功能的生物集团成立手动油脂介孔膜蛋白的结晶试验实施的过程。

Abstract

使用油脂介孔膜蛋白结晶的一个详细的协议描述。这种方法有不同的被称为油脂立方相， 或在中观方法。该方法已被证明是相当通用的，因为它已被用于解决X射线晶体结构的原核和真核细胞的蛋白质，蛋白质是单体，同源异多聚体，生色含和生色，和alpha螺旋和β-管蛋白。最近取得的成功观的结晶，是人类设计的β2-肾上腺素和腺苷A2A G蛋白偶联受体。协议提出的重组膜蛋白的monoolein为基础的中间相，并设立在手动模式下的结晶。额外的步骤，在整个过程中，如水晶收获，要在未来的视频文章处理。所需的时间准备蛋白质装载的中间相，并设立结晶板，手工大约一个小时。

Protocol

在结构和功能的生物学领域的一个重要的重点是生物膜（图1）。膜，周围的细胞和亚细胞器出现时，只有两个脂质分子一个分子薄结构和与蛋白质云集。适用于脂质和蛋白质的结构和功能的利益。然而，本文的重点是限制膜蛋白。

寻求一个更好地了解如何在分子水平上的膜蛋白的功能是有两个原因。首先，是在知道他们是如何工作的智力满意。其次，通过了解蛋白质是如何工作的，总是能够解决应该发生故障或改善，甚至为特定的应用程序修改它的前景。药物设计是明显的这种类型的工作成果。辩别如何在分子水平上的一种膜蛋白的一种方法是，以确定其结构。这包括建立所有原子在三维空间的位置，或至少所有非氢原子，使蛋白质。我们为此目的使用的方法是大分子的X -射线结晶器（MX）。图2显示了一种膜蛋白的结构被确定使用MX的例子。衍射质量的蛋白质晶体是需要做的MX。

显然，使用大分子晶体结构的测定中涉及的许多步骤。图3说明了这一点。通常情况下，这些包括确定膜蛋白的目标，然后生产，提纯和结晶。使用一个家庭或一个同步辐射X射线源的晶体衍射测量上执行。高产与分子模型，然后将其安装的电子密度图的衍射数据处理。成品时，该模型，可以用于探索的蛋白质的作用机制和基于结构的药物设计。

本文的重点是显示我们如何产生所谓的中观方法使用脂质介孔的膜蛋白晶体衍射质量，的。最近进行的检讨的方法，其范围是在参考文献1（卡弗里，2009）。一步一步的协议，我们将按照这里的描述，在参考文献2（卡弗里和Cherezov，2009）。

总结参与设立一个中间膜蛋白结晶试验要求和时间步骤的流程图如图4所示。本文介绍了红色虚线线内的那些步骤。

第1部分：准备结晶板

1. 在工作​​台上的位置硅烷显微镜幻灯片。
2. 删除从一个带（市售，看到的特定试剂和设备下面的表）的穿孔双节棍间隔磁带表面的保护纸盖。
3. 胶带，粘面朝下放置，与表面的幻灯片接触。
4. 压力密封的磁带，幻灯片使用brayer或辊。可以放在铝箔之间的磁带和辊保护的水井的基础。
5. 从磁带中删除第二个纸盖，露出其上粘表面。
6. 的地方，个别硅烷盖玻片接近井快速高效的密封板，为尽快装载完成。

第2部分：准备脂质注射器

1. 脂质（常monoolein）放置在45 ° C 3分钟来渲染它熔融温度控制块。
2. 而脂质是融化准备在脂质蛋白混合步骤使用两个100μL气密汉密尔顿注射器。特氟隆卡环取下注射器将包含蛋白质溶液。将注射器将举行脂旁边（留在地方套圈）。
3. 耦合器的连接（请参阅表的特定试剂和设备下面，参考3（ 程等 。1998年））脂质注射器。用手拧紧耦合注射器，但不要过度拧紧。删除从每桶脂质注射器的柱塞。
4. 注意脂质必须熔化，然后再继续。设置移液器至30μL，慢慢约30μL熔融脂。慢慢地，你可以提供开放的照顾，不引入空气间隙的注射器结束熔融脂质。
5. 在与熔化的脂质接触，并慢慢地推进了每桶举行垂直视频显示注射器的柱塞，柱塞放入桶。空气可能无意中被困气泡上升的过程中被释放。
6. 仔细确定阅读的针筒上的标记，在注射器中的脂质量。
7. 滑动的FERRULE到从耦合器的扩展针。使用柱塞力了，慢慢地，轻轻地进入在耦合器的核心针桶和熔融脂质。

第3部分：准备蛋白质注射器

1. 纺14,000克蛋白质溶液应为5到10分钟，4 ° C到删除前设立的结晶试验的大聚合。从冰中取出的蛋白质溶液，并允许它在室温下平衡。
2. 计算蛋白质溶液的体积使用，形成了立方相或接近充分水化。对于monoolein在20℃，与水充分水化发生在⁵相图（图5），在接近40％的水（质量） 。
3. 随着一个25或50μL汉密尔顿注射器所需的蛋白质溶液体积。转移到聚四氟乙烯在每桶照顾，以避免气泡的蛋白质注射器的柱塞提示的解决方案。
4. 仔细撤回的针头和措施注射器中的蛋白质的解决方案的体积。它应该在上一步中提供的值相匹配。
5. 慢慢英寸了每桶蛋白质的解决方案，最终其开口端平齐。
6. 脂质注射器相连的耦合器的开口端拧入的蛋白质注射器。这是关键设备不能过分收紧。过度紧缩组装的搅拌装置，在这个阶段会损坏密封垫圈，造成泄漏。在紧缩也会导致漏水。

第4部分：混合蛋白质溶液和脂质：使中间相

1. 效果混合，混合机组组装到了极限的蛋白质方提前柱塞，用拇指或食指驾驶的蛋白质注射器的蛋白质溶液，通过耦合器和成脂质注射器。
2. 柱塞脂质方现在使用的驱动器通过耦合器和脂质注射器的蛋白质注射器的内容。
3. 这个过程是反复多次;偶尔，一百通道或以上须出示一个同质的中间相。在启动的混合材料通过耦合器来回运动可以是不平衡的，有时，，需要额外的力量是影响混合。通常伴随着最初的混合样品中的非均匀混浊的发展。由于同质化的不断进步，质地变得更均匀，粘性立方相的特征，作为新兴立方米中间相的视觉外观。
4. 如果条件合适和立方相形式，应该出现的色散光学透明的针筒。因此，针筒上的标记应清晰易读通过在桶的中间相。
5. 很轻微的混合冷却过程中的样品放置的时间很短，在冰上注射器混频器，可以加速同质化和透明度成就。然而，重要的是不overcool样品。
6. 应谨慎，以避免极其严厉的混合，因为这可能会导致样品的温度上升是由于摩擦^加热 3 。

第5部分：载入饮水机

1. 删除从10μL汉密尔顿注射器的针头和柱塞。留在原地的特氟隆卡环。
2. 删除从一个小硬币的援助饮水机的固定螺母。
3. 随着棘轮手臂完全抽出，插入注射器 - 无柱塞和针 - 通过控股的饮水机环。
4. 更换的固定螺母，垫片面朝注射器，注射器开放紧紧拧。
   应采取的注射器，以确保是正确控股环和中心的桶是平行的棘轮手臂的。都可以用肉眼来判断。这两个方面的要求是至关重要的，以避免泄漏。
5. 通过抓环柱塞与夹持螺母拧开了几圈，并引导到注射器的开口端柱塞。完全压下棘轮手臂。移动到每桶柱塞和检查，它的旅行自由和真正的桶。它可以帮助指导栏上松开螺丝，以方便自由移动的柱塞。确保它。压下活塞，直到其聚四氟乙烯提示μL桶零刻度线对齐。如果指导栏上的螺丝松动，拧紧它，并重新检查，柱塞可自由移动。
6. 组装的混合机组一侧移动，柱塞零μL刻度的中间相转移到其他注射器和耦合器。
7. 断开混合机组的空注射器（其在地方套圈），并立即装入注射器连接 - 耦合器一个ttached - 10μL配药注射器线程终止。松紧程度与耦合是非常关键，正如已经指出的。
8. 令人沮丧的100μL注射器的柱塞，使负载配药注射器通过耦合器的中间相转移。
9. 钢终止配药注射器安全短，平头的针，小心地拧紧到位。
10. 柱塞钳棘轮臂抓环拧紧螺母。应注意不要过分拧紧螺母，因为这可以得分和变形，柱塞，使其无法使用。重要的是提供棘轮臂夹紧条件的行程范围是有限的，以不超过一英寸，在视频显示。除此之外，活塞将有一种倾向，扣和交付失败。
11. 压下棘轮鼓几次提前在每桶柱塞，从而填补针的空隙体积和装载针。应重复此步骤（最多10次），直到一个连续字符串的中间相出现针尖。
12. 结晶试验应立即开始，一些蛋白质在不加沉淀立方相的不稳定。

第6部分：设置结晶板

1. 放置一个多井的结晶板和表面上的盖玻片提出为便于装载工作台以上几英寸。最佳的对比度和增强可视性是实现时，表面上是略暗。
2. 均匀沉淀的解决方案和摘帽的小瓶。设置为1μL沉淀配药吸管。
3. 一方面垂直举行的配药注射器，使用腾出手来在中心和基地以及数字1以上的针尖位置。按重复饮​​水机上的按钮驱逐到玻璃表面的中间相丸。推注量为200 NL时10μL注射器使用标准的重复饮水机。针尖应不超过几百微米以上的良好基础，以确保正确的交付。
4. 经过4个相邻井的中间相，1μL沉淀溶液使用2μL的吸管和标准一次性提示每个中间相丸上装载。
5. 尽快正视盖玻片放在充满井，覆盖均匀。要影响一个防水密封，用锅铲施加压力，以使暴露的间隔胶带粘物表面接触的盖玻片。
6. 中间相和沉淀配药过程可以反复进行，直至盘上所有井装载和密封。
7. 明确标示板，用于跟踪目的。感光蛋白质通常是由铝箔包装之前，他们在孵化室的板处理。
8. 放置在温度控制腔板，通常在20 ° C。
9. 定期的时间表，晶体生长的检查井，偏振光显微镜使用10或20倍的目标。在笔者的实验室中使用的时间表如下：0，1，2，3，5，7，14，21，30和60安装后。调整聚焦深度在0.14毫米厚的样品，仔细检查中间相丸。考试应在正常光线和交叉偏光片之间。

第7部分：代表结果

导致晶体的外观将随膜蛋白的固有色，光的偏振用于检查（或缺乏）和照明的方法和质量。图6显示了几个可能的晶体出场。自然色的膜蛋白，在观日益正常光线查看时，在图6（b和d面板）所示的样子。无色透明的膜蛋白晶体，越来越多立方相正常光线查看时，可以在图6（小组E）所示的样子。最后，无色的膜蛋白晶体中观的偏振光观察时，可以像图6（面板A和C ）。

在结构测定的整个过程中的下一个步骤是收获和低温冷晶体，并记录和分析他们的X -射线衍射。这些主题都是在单独的朱庇特的文章。

图1显示了生物上的脂质双层膜的示意图，位于多种蛋白质。

图2的结构。维生素B ₁₂运输蛋白，BtuB，解决使用MX和在此朱庇特的文章^中 说明 6细观方法生长的晶体。

图3。结构与功能的周期，说明许多在完成有关的一种蛋白质的结构信息获取和利用所涉及的步骤。

图4。流程图总结细观方法在膜蛋白晶体的生产所涉及的步骤。只有那些虚线红线包围的步骤包括在此朱庇特的文章。从参考2。

图5。一个简化的温度成分为脂质（monoolein）/水体系相图。结晶试验，成立于20 ° C，其中40％水合脂与水饱和。详细的相图是在参考文献5。

图6。油脂中间相生长的膜蛋白质晶体。
（一）维生素B _12的运输蛋白质，BtuB ^6，（二）捕光色素复合物^{Ⅱ7，（C）}黏附/ invasin OPCA ^{8，（D）9，}细菌视紫红质（E）从假单胞菌碳水化合物转运。拍摄的图像与正常光线（B，D，E）和交叉偏光片（A，C）之间。

Discussion

立方相是一个微妙的和动态的环境可以改变一个变量的数目急剧变化。这是不可能的，给予说明在手动模式下，描述了所有潜在的隐患的中间结晶试验的设置。然而，许多困难，可避免通过练习前把它应用到昂贵的蛋白质溶液的技术和应用在混合注射器的压力放缓。做得正确， 在中观方法可以产生各种各样的蛋白质晶体，其数量是不断增加。

这里设置在中间的结晶试验的描述主要集中在手动模式。这个过程就可以了，经常被修改，以促进在这些情况下，需要大规模的结晶条件筛选的结晶板自动设置。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Protein solution	Reagent	Various	Various
Lipid (monoolein)	Reagent	Sigma-Aldrich	Various
Precipitant solutions	Reagent	Various	Various
Purified water	Reagent	EMD Millipore
Pipetting devices	Tool	Pipetman	Various
Disposable pipet tips	Disposable	Pipetman	Various
Gas-tight syringes	Tool	Hamilton Co	80265 (25-µl)
Syringe tips	Tool	Hamilton Co	7770-020 (gauge 22)
Narrow bore coupler*	Tool	Hamilton Co	various/EBS-LCP-2
Repeating dispenser	Tool	Hamilton Co	83700
Silanized glass microscope slides	Disposable	Gold Seal	3010
microscope coverslips	Disposable	Fisher Scientific	12-548C
Perforated double-stick spacer tape	Disposable	Saunders Corporation (hole-punched)	NA
Tweezers	Tool	Various	NA
Brayer (roller)	Tool	Fisher Scientific	50820937
Chipped ice	Temperature Control	N/A	NA
Tissues	Disposable	N/A	NA
Calculator	Tool	Various	NA
Lab notebook	Tool	Various	NA
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.