Summary
该视频将演示如何从夏威夷短尾乌贼的血细胞（血细胞），
Abstract
有关免疫系统的作用，在调解有益的细菌和主机之间的分子信号研究，近年来，我们与他们的菌群真核生物的共同进化理解作出了重大贡献。夏威夷短尾鱿鱼之间的共生协会，
Protocol
- 准备500 0.22微米的过滤器消毒的人工海水MLS（FSW;盐度35个百分点）。 0.22微米微米的过滤器过滤器通过人工或自然海水去除微粒和细菌。
- 麻醉放置在2％的乙醇解决方案，在FSW一个成年人夏威夷短尾鱿鱼（Euprymna scolopes） 。约10分钟，放置在麻醉的动物。鱿鱼将停止游泳，并不会积极响应触摸。持续呼吸，表明地幔的运动，和色素细胞活动仍然应该遵守。
- 面临的一个标准蜡剥离托盘腹朝上放置的鱿鱼。 FSW含有2％的乙醇浸泡动物。
- 使用一个标准的200μL枪头，拉回来漏斗和地幔位于两只眼睛之间的主要头侧血管暴露。
- 26.5号针头，穿刺头侧血管，并撤回在50-100微升血淋巴使用无菌1 mL注射器。在无菌的1.5 mL试管放置在冰血淋巴。
注：如果动物将作为捐助者多次，只有在任何时候撤回10-20微升血淋巴。动物返回正常海水的水箱。动物将恢复在30分钟内。 - 新鲜采集的血细胞洗涤和鱿鱼林格的解决方案（S -林格; 530毫米氯化钠，氯化钾10毫米，25毫米MgCl 2的，10毫米氯化钙 2和10毫米的HEPES缓冲，pH值7.5）在500μL重悬。
- 血细胞的浓度是由血球，以及约2,000个单元格添加到腔玻璃盖玻片，并允许在室温下10分钟，坚持玻璃。在这个密度，血细胞载玻片表面上形成一个统一的单层。
- 为了观察细菌绑定到主机上的血细胞，血细胞接触到荧光标记的菌株，如弧菌鲵 ES114和/或哈维氏弧菌 B392，每片含绿色荧光记者。 五 。 ES114和五鲵哈维 B392成长日志中期阶段在海水蛋白胨媒体（SWT）在28 °的轨道摇床中的C。分光光度计在600nm处的光密度测量，以确定细胞密度。细菌颗粒离心5分钟（5,000 RPM），丢弃上清液，沉淀是在S -林格重悬。
- 10万个细菌细胞被添加到每个分庭，以便有50％的平均血细胞细菌。血细胞/细菌混合物孵育中的S -林格的解决方案在25 ° C为1小时，时间确定产生约束力的最高水平。
- 血细胞的细胞质中，然后荧光染色与0.005％CellTracker橙（Invitrogen公司），然后在S -林格洗净，以可视化的细胞。
- 被视为相关的细菌染色的血细胞荧光使用蔡司发现V20荧光立体或徕卡SP2光谱激光共聚焦显微镜，并在整个动物细胞表面列举。
代表性的成果
由于头足类动物血淋巴中含有外血蓝蛋白，而不是后氧合血红蛋白，血淋巴中会变成深蓝色。 〜5000μL的血淋巴血细胞的平均使用这种方法获得。坚持腔盖玻片，荧光染色后，血细胞应该会出现明亮的荧光红色和形状的变形虫。对于细菌粘附， 五鲵将坚持不佳的血细胞（血细胞每1-2细菌细胞），而五哈维将坚持强（10-15％血细胞细菌细胞）。
图1。成人夏威夷短尾鱿鱼Euprymna scolopes显示头侧血管的位置。
图2：血细胞暴露于弧菌鲵（A） 和哈维氏弧菌（二）的结果。红，细胞跟踪橙，绿，GFP标记的细菌。
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Discussion
有关免疫系统的作用，在调解有益的细菌和主机之间的分子信号研究，近年来，我们与他们的菌群真核生物的共同进化理解作出了重大贡献。鱿鱼/弧菌系统本身已经证明了作为一个听话的模型系统回答在这一领域的根本性问题2,3,5,6,8。鱿鱼Euprymna scolopes光器官允许殖民统治完全由发光弧菌鲵 。由于房子的组织，保持与海水接触的细菌，鱿鱼，必须不仅促进具体的共生还要继续，以排除其他细菌。续研究发现，巨噬细胞样血细胞可能发挥重要作用，在建立和维护本协会1,4,7。由于鱿鱼主机缺乏适应性免疫，在这个协会中发现惊人的特异性，必须通过全部或部分介导的先天免疫系统。一个最近的调查显示，这些血细胞，血细胞从 E隔离scolopes识别和吞噬V 。 鲵和非共生细菌的差异和殖民化可能导致的“免疫耐受”的共生体 4的类型。该协议将展示如何成功地获得这些血细胞从成年鱿鱼和测试自己的能力，结合细菌。
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Acknowledgments
资金来源：康涅狄格州大学研究基金会和分子和细胞生物学系到SVN，西格玛郗赠款援助的研究和安东尼H.和Majorie R.
普罗迪研究生教育奖学金，以AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
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