Summary
Deze video zal laten zien hoe je hemocytes (bloedcellen) te verkrijgen van de Hawaiiaanse Bobtail inktvis,
Abstract
Onderzoek naar de rol van het immuunsysteem in het bemiddelen moleculaire signalering tussen de heilzame bacteriën en hun gastheer hebben in de afgelopen jaren belangrijke bijdragen geleverd aan ons begrip van de co-evolutie van eukaryoten met hun microbiota. De symbiotische relatie tussen de Hawaiiaanse Bobtail inktvis,
Protocol
- Bereid 500 ml van 0,22 um filter gesteriliseerde kunstmatig zeewater (FSW, zoutgehalte 35 ppt). Filter kunstmatige of natuurlijke zeewater door een 0,22 um micron filter om deeltjes en bacteriën te verwijderen.
- Verdoven een volwassen Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes) door plaatsing in een 2% oplossing van ethanol in FSW. Plaats het dier in narcose voor ongeveer 10 minuten. De inktvis zal ophouden te zwemmen en zal niet actief inspelen op te raken. Vervolg ademhaling, aangegeven door beweging van de mantel, en Chromat activiteit moet nog worden genomen.
- Plaats inktvis met ventrale zijde naar boven op een standaard wax dissectie lade. Dompel het dier met FSW met 2% ethanol.
- Met behulp van een standaard 200 ul pipetpunten, trek de trechter en mantel tot de belangrijkste cefalische bloedvat gelegen tussen de twee ogen bloot te leggen.
- Met behulp van een steriele 1 ml spuit met 26,5-gauge naald, prik de cefalische bloedvat en trekt tussen 50-100 pi hemolymfe. Plaats de hemolymfe in een steriele 1,5 ml buis op ijs.
Opmerking: Als een dier zal dienen als een donor meerdere keren, slechts 10-20 ul hemolymfe te trekken op een gegeven moment. Ga terug het dier naar een normaal zeewater tank. Het dier zal doen herleven binnen de 30 minuten. - Vers verzameld hemocytes worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in 500 pi van de oplossing Squid Ringer s (S-Ringers, 530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl2, 10 mM CaCl 2 en 10 mM HEPES buffer, pH 7,5).
- Hemocyte concentraties worden bepaald door hemocytometer, en ongeveer 2.000 cellen worden toegevoegd aan chambered glas dekglaasjes, en mag om het glas houden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bij deze dichtheid, de hemocytes vormen een uniform monolaag op het glaasje oppervlak.
- Te observeren bacteriële binding aan gastheer hemocytes, zijn hemocytes blootgesteld aan een fluorescent gelabelde bacteriestam zoals Vibrio fischeri ES114 en / of Vibrio harveyi B392, elk met een groen fluorescerend verslaggever. V. fischeri ES114 en V. harveyi B392 zijn gegroeid tot mid-log fase in een zeewater trypton media (SWT) bij 28 ° C in een rondschudapparaat. De optische dichtheid bij 600 nm is spectrofotometrisch gemeten om celdichtheid te bepalen. De bacteriën worden gepelleteerd door centrifugeren (5000 rpm gedurende 5 min), wordt het supernatant verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in S-Ringers.
- 100.000 bacteriële cellen worden toegevoegd aan elke kamer goed, zodat er 50 bacteriën per hemocyte gemiddeld. De hemocyte / bacterie mengsels worden geïncubeerd in een oplossing S-Ringer s bij 25 ° C gedurende 1 uur, een tijd vastbesloten om het maximale niveau van binding opbrengst.
- Het cytoplasma van de hemocytes worden dan fluorescerend gekleurd met 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) en vervolgens gewassen in S-Ringers naar de cellen te visualiseren.
- Stained hemocytes met bijbehorende bacteriën worden bekeken door fluorescentie met behulp van een Zeiss Discovery V20 TL stereoscoop of een Leica SP2 spectraal laser confocale microscoop, en opgesomd over het gehele oppervlak van de dierlijke cel.
Representatieve resultaten
Omdat koppotigen hemolymfe bevat extracellulaire hemocyanine en niet hemoglobine, op oxygenatie, zal de hemolymfe donker blauw. Een gemiddelde van ~ 5000 hemocytes per il van hemolymfe zullen worden verkregen met behulp van deze methode. Na de naleving van de chambered dekglaasjes en fluorescerende kleuring, moet de hemocytes verschijnen helder fluorescent rood en amoeboid in vorm. Voor bacteriële hechting, V. fischeri zal slecht houden aan de hemocytes (1-2 bacteriële cellen per bloedcel), terwijl V. harveyi sterk zal hechten (10-15 bacteriële cellen per hemocyte).
Figuur 1. Adult Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes toont positie van cefalische bloedvat.
Figuur 2. Resultaten van hemocyte blootstelling aan Vibrio fischeri (A) en Vibrio harveyi (B). Rood, Cell Tracker Oranje, Groen, GFP-gemerkte bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek naar de rol van het immuunsysteem in het bemiddelen moleculaire signalering tussen de heilzame bacteriën en hun gastheer hebben in de afgelopen jaren belangrijke bijdragen geleverd aan ons begrip van de co-evolutie van eukaryoten met hun microbiota. Het squid / Vibrio-systeem heeft zich bewezen als een soepel model systeem om fundamentele vragen op dit gebied 2,3,5,6,8 te beantwoorden. Het licht-orgel van de inktvis Euprymna scolopes vergunningen kolonisatie uitsluitend door de lichtgevende bacterie Vibrio fischeri. Omdat de weefsels die het huis van de bacterie in contact blijven met zeewater, moet de inktvis niet alleen stimuleren van de specifieke symbiose, maar blijven ook andere bacteriën uit te sluiten. Vervolg studies hebben aangetoond dat macrofagen-achtige hemocytes waarschijnlijk een belangrijke rol bij het opzetten en onderhouden van deze vereniging 1,4,7 te spelen. Omdat de inktvis gastheer ontbreekt adaptieve immuniteit, de verbazingwekkende specificiteit gevonden in deze vereniging moet geheel of gedeeltelijk gemedieerd worden door middel van het aangeboren immuunsysteem. Een recent onderzoek naar deze bloedcellen toonde aan dat hemocytes geïsoleerd van E. scolopes herkennen en fagocyteren V. fischeri en niet-symbiotische bacteriën differentieel en dat kolonisatie leidt waarschijnlijk tot een soort "immuun tolerantie" van de symbionten 4. Dit protocol zal laten zien hoe succesvol deze bloedcellen van volwassen inktvis te verkrijgen en testen hun vermogen om bacteriën te binden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Financieringsbronnen: University of Connecticut Research Foundation en het ministerie van Moleculaire en Cellulaire Biologie aan SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-van onderzoek en Antonio H. en R. Majorie
Romano Graduate Education Fellowship voor AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
