Summary
Dieses Video wird zeigen, wie Blutzellen (Blutkörperchen) aus dem hawaiianischen Bobtail Squid zu erreichen,
Abstract
Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Die symbiotische Beziehung zwischen den Hawaii-Bobtail Tintenfisch,
Protocol
- Bereiten Sie 500 ml 0,22 um Filter-sterilisiert künstlichem Meerwasser (FSW; Salzgehalt 35 ppt). Filter künstlichen oder natürlichen Meerwasser durch ein 0,22 um-Mikron-Filter zur Entfernung von Partikeln und Bakterien.
- Anesthetize einen Erwachsenen Hawaiian Bobtail Squid (Euprymna scolopes), indem Sie in eine 2% ige Lösung von Ethanol in FSW. Legen Sie das Tier in Narkose für etwa 10 Minuten. Der Tintenfisch wird aufhören Schwimmen und sich nicht aktiv auf Berührung reagieren. Fortsetzung Atmung, angegeben durch die Bewegung der Mantel und Chromatophor Aktivität sollte noch beachtet werden.
- Legen Tintenfisch mit Bauchseite nach oben auf einem Standard-Wachs Dissektion Fach. Tauchen Sie das Tier mit FSW mit 2% Ethanol.
- Mit einem Standard 200 ul Pipettenspitzen, ziehen Sie den Trichter und Mantel zu den wichtigsten cephalica Blutgefäß zwischen den beiden Augen entfernt aussetzen.
- Mit einer sterilen 1 ml-Spritze mit 26,5-Gauge-Nadel, Punktion der V. cephalica Blutgefäß und ziehen zwischen 50-100 ul Hämolymphe. Legen Sie die Hämolymphe in ein steriles 1,5 ml-Röhrchen auf Eis.
Hinweis: Wenn ein Tier als Spender mehrfach dienen soll, nur zurücktreten, 10-20 ul der Hämolymphe zu einem bestimmten Zeitpunkt. Zurück das Tier zu einem normalen Meerwasseraquarium. Das Tier wird innerhalb von 30 min wieder zu beleben. - Frisch gesammelte Blutzellen werden gewaschen und resuspendiert in 500 ul von Squid Ringer Lösung von (S-Ringers, 530 mm NaCl, 10 mM KCl, 25 mM MgCl 2, 10 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,5).
- Hemocyte Konzentrationen werden durch Zählkammer bestimmt, und etwa 2.000 Zellen werden chambered Glasdeckgläschen hinzugefügt, und man ließ sie auf das Glas für 10 min bei Raumtemperatur zu halten. Bei dieser Dichte, bilden die Blutzellen eines einheitlichen Monolage auf dem Glas Gleitfläche.
- Zur Beobachtung bakterielle Bindung an Host Blutzellen sind Blutzellen zu einer fluoreszenzmarkierten Bakterienstamm wie Vibrio fischeri ES114 und / oder Vibrio harveyi B392, die jeweils eine grün fluoreszierende Reporter ausgesetzt. V. fischeri ES114 und V. harveyi B392 sind bis Mitte der log-Phase in einem Meerwasser-Trypton Medien (SWT) bei 28 ° C in einem Schüttler gewachsen. Die optische Dichte bei 600nm spektrophotometrisch die Zelldichte zu bestimmen. Die Bakterien werden durch Zentrifugation (5.000 rpm für 5 min), der Überstand verworfen und das Pellet wird in S-Ringers resuspendiert.
- 100.000 Bakterienzellen werden mit jeder Kammer hinzugefügt gut so, dass gibt es 50 Bakterien pro hemocyte im Durchschnitt. Die hemocyte / Bakterien Mischungen werden in S-Ringer s-Lösung bei 25 ° C für 1 h, eine Zeit bestimmt, um die maximale Höhe der Bindungsausbeute inkubiert.
- Das Zytoplasma der Blutzellen werden dann fluoreszierend mit 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen) gefärbt und anschließend gewaschen in S-Ringers, um die Zellen zu visualisieren.
- Stained Blutzellen mit assoziierten Bakterien werden durch Fluoreszenz betrachtet entweder mit einem Zeiss Entdeckung V20 fluoreszierenden Stereoskop oder eine Leica SP2 spektrale Laser konfokalen Mikroskop und zählte über die gesamte Oberfläche der tierischen Zelle.
Repräsentative Ergebnisse
Da Kopffüßer Hämolymphe enthält extrazellulären Hämocyanin und nicht Hämoglobin, auf Sauerstoffzufuhr wird die Hämolymphe wiederum dunkelblau. Ein Durchschnitt von ~ 5000 Haemocyten pro ul Hämolymphe wird man mit dieser Methode. Nach Einhaltung der Kammern Deckgläser und Fluoreszenzfärbung, sollte die Blutzellen erscheinen hell fluoreszierend rot und amöboide Form. Für bakterielle Adhäsion, V. fischeri wird schlecht haften, die Blutzellen (1-2 Bakterienzellen pro Blutkörperchen), während V. harveyi wird stark kleben (10-15 Bakterienzellen pro hemocyte).
Abbildung 1. Adult Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes zeigt Lage der cephalica Blutgefäß.
Abbildung 2. Die Ergebnisse der hemocyte Exposition gegenüber Vibrio fischeri (A) und Vibrio harveyi (B). Red, Cell Tracker Orange; Green, GFP-markierten Bakterien.
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Discussion
Studien über die Rolle des Immunsystems bei der Vermittlung von molekularen Signale zwischen nützlichen Bakterien und ihren Wirten haben, in den letzten Jahren bedeutende Beiträge zu unserem Verständnis der Ko-Evolution von Eukaryonten mit ihrer Mikroflora. Der squid / vibrio System hat sich als gefügig Modellsystem, um grundsätzliche Fragen in diesem Bereich 2,3,5,6,8 beantworten bewährt. Das Licht-Orgel des Tintenfisches Euprymna scolopes erlaubt Kolonisierung ausschließlich durch die leuchtende Bakterium Vibrio fischeri. Da das Gewebe, das Haus der Bakterien in Kontakt mit Meerwasser zu bleiben, muss der Tintenfisch nicht nur fördern, die spezifische Symbiose, sondern auch weiterhin auf andere Bakterien auszuschließen. Fortsetzung Studien haben gezeigt, dass Makrophagen-ähnliche Blutzellen wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen bei der Einrichtung und Wartung des Vereins 1,4,7. Da die Tintenfische Host fehlt erworbenen Immunität, die erstaunliche Spezifität in diesem Zusammenhang gefunden werden muss, ganz oder teilweise vermittelt durch das angeborene Immunsystem. Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung dieser Blutzellen gezeigt, dass Blutzellen von E. isoliert scolopes erkennen und phagozytieren V. fischeri und nicht-symbiotischen Bakterien unterschiedlich und Kolonisierung wahrscheinlich führt zu einer Art "Immuntoleranz" der Symbionten 4. Dieses Protokoll wird zeigen, wie erfolgreich erhalten diese Blutzellen aus erwachsenen Tintenfische und testen ihre Fähigkeit, Bakterien zu binden.
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Acknowledgments
Finanzierungsquellen: University of Connecticut Research Foundation und dem Department of Molecular and Cell Biology an SVN, Sigma Xi Grant-in-Aid-Forschung und Antonio H. und R. Majorie
Romano Graduate Education Fellowship zu AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
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