Summary
Bu video, Hawaii kuyruğu kesik kalamar hemocytes (kan hücreleri) elde etmek için nasıl göstereceğiz
Abstract
Bağışıklık sisteminin moleküler sinyal yararlı bakteri ve ev sahipleri arasında arabuluculuk rolü ile ilgili çalışmalar, son yıllarda, kendi Mikrobiyota ökaryotlarda eş-evrim anlayışımıza önemli katkılarda bulunmuşlardır. Hawaii kuyruğu kesik kalamar arasındaki simbiyotik ilişki,
Protocol
- 0.22 mikron filtre ile sterilize edilmiş yapay deniz suyu, 500 mL (tuzluluk 35 ppt FSW) hazırlayın. 0.22 mikron mikron filtre süzülür yapay ya da doğal deniz suyu parçacıklar ve bakteriler kaldırmak için.
- FSW etanol% 2'lik bir çözüm koyarak bir yetişkin Hawaiian kuyruğu kesik kalamar (Euprymna scolopes) anestezisi. Yaklaşık 10 dakika için anestezi hayvan yerleştirin. Kalamar yüzme sona erecek ve aktif dokunmatik yanıt vermez. Devamı solunum, manto hareket tarafından belirtilen ve chromatophore aktivite hala dikkat edilmelidir.
- Kalamar, standart bir balmumu diseksiyonu tepsisine yukarı bakacak şekilde ventral yüzü koyun. FSW% 2 oranında etanol içeren hayvan Batmak.
- Bir standart 200 ul pipet uçları kullanarak, huni ve manto, iki göz arasında bulunan ana sefalik kan damarı ortaya çıkarmak için geri çekin.
- 26.5 iğne, delinme sefalik kan damarı ve hemolimf 50-100 ul arasında çekilme ile 1 ml steril bir şırınga kullanarak. 1,5 mL steril bir tüp içinde buz üzerinde hemolimf yerleştirin.
Not: bir hayvan birden çok kez bir bağış olarak hizmet verecek herhangi bir zamanda, sadece 10-20 ul hemolimf çekilme. Normal bir deniz suyu tankı hayvan dönün. 30 dakika içinde hayvan ihya edecek. - Taze toplanan hemocytes 500 ul Squid Ringer solüsyonu (530 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 MgCl 2 mM, 10 mM CaCl 2 ve 10 mM HEPES tamponu, pH 7.5, S-Zil) ile yıkandı ve tekrar askıya alınır.
- Hemocyte konsantrasyonları hemasitometre tarafından belirlenir ve yaklaşık 2.000 hücre odacıklı cam kapak fişleri eklenir ve oda sıcaklığında 10 dakika için cam uymak için izin verilir. Bu yoğunluk, hemocytes cam slayt yüzeyinde düzgün bir tek tabaka oluşturur.
- Konak hemocytes bağlayıcı bakteri gözlemlemek için, hemocytes Vibrio fischeri ES114 ve / veya Vibrio harveyi B392, her bir yeşil floresan muhabiri içeren gibi floresan etiketli bir bakteri suşunun maruz kalmaktadır. V. fischeri ES114 ve V. harveyi B392 28 deniz suyu Tripton medya (cc) orta-log fazı ° C orbital çalkalayıcı yetiştirilmektedir. 600Nm optik yoğunluk hücre yoğunluğu belirlemek için spektrofotometrik olarak ölçülür. Bakteri santrifüj (5 dakika için 5.000 rpm) pelet, süpernatantı atılır ve pelet S-Zil sesleri yeniden askıya alınır.
- 100,000 bakteri hücrelerinin de bu yüzden başına 50 ortalama hemocyte bakteri olduğunu her iki mecliste de eklenir. Hemocyte / bakteri karışımları S-Ringer solüsyonu 25 ° C 1 saat, bağlama maksimum düzeyde verim belirlenen bir süre inkübe edilir.
- Sitoplazma hemocytes sonra floresan% 0.005 CellTracker Orange (Invitrogen) ile boyandı ve sonra hücrelerin görselleştirmek için S-Zil yıkanır.
- Ilişkili bakteri ile Vitray hemocytes bir Zeiss Discovery V20 floresan Stereoskop veya Leica SP2 spektral lazer konfokal mikroskop ya kullanılarak floresans tarafından görüntülenebilir ve hayvan hücre, tüm yüzey üzerinde numaralandırılan.
Temsilcisi Sonuçlar
Kafadan hemolimf oksijenasyon üzerine ekstrasellüler hemosiyanin ve hemoglobin içerdiğinden hemolimf, koyu mavi dönecektir. Bu yöntemi kullanarak ~ 5000 hemocytes hemolimf, ul başına ortalama elde edilecektir. Odacıklı kapak fişleri ve floresan boyama bağlılık sonra, hemocytes şeklinde parlak floresan kırmızı ve amoeboid görünmelidir. Bakteriyel yapışma için, V. fischeri ise V. (1-2 bakteri hücrelerinin kan hücresi başına) hemocytes kötü uyacaktır harveyi (ortalama 10-15 bakteri hücrelerinin hemocyte) Kesinlikle uyacaktır.
Şekil 1. Yetişkin Hawai kuyruğu kesik kalamar Euprymna sefalik kan geminin konumunu gösteren scolopes.
Şekil 2 Vibrio fischeri (A) ve Vibrio harveyi (B) hemocyte maruz kalma. : Kırmızı, Hücre Tracker Turuncu, Yeşil, GFP-etiketli bakteri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağışıklık sisteminin moleküler sinyal yararlı bakteri ve ev sahipleri arasında arabuluculuk rolü ile ilgili çalışmalar, son yıllarda, kendi Mikrobiyota ökaryotlarda eş-evrim anlayışımıza önemli katkılarda bulunmuşlardır. Squid / vibrio sistemi, bu alanda 2,3,5,6,8 temel soruları yanıtlamak için bir uysal bir model sistem olarak kendini kanıtlamıştır. Kalamar Euprymna scolopes ışık organ ışık bakteri Vibrio fischeri tarafından özel olarak kolonizasyon izin verir. Dokular o evde bakteriler, deniz suyu ile temas halinde kalması için, kalamar özel simbiyoz sadece teşvik değil, aynı zamanda diğer bakterileri dışarıda devam etmemelidir. Devamı çalışmalar makrofaj gibi hemocytes muhtemelen 1,4,7 bu ilişki kurulması ve bakımı önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur. Kalamar konak adaptif bağışıklık, bu ilişki bulunan şaşırtıcı özgüllüğü doğuştan gelen bağışıklık sistemi aracılığıyla bütün olarak veya kısmen aracılık olmalıdır yoksun. Bu kan hücreleri yeni bir soruşturma hemocytes E. izole olduğunu ortaya scolopes tanımak ve fagosite V. fischeri ve non-simbiyotik bakteriler farklı ve kolonizasyonu büyük olasılıkla symbionts 4 "immün tolerans" bir tür yol açar . Bu protokol, yetişkin kalamar başarıyla bu kan hücreleri elde etmek ve bakteri bağlamak için yeteneklerini nasıl test gösterecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansman Kaynakları: SVN, Connecticut Araştırma Vakfı ve Moleküler ve Hücre Biyolojisi Bölümü Üniversitesi, Sigma Xi Grant Yardım Araştırma ve Antonio H. ve Majorie R.
Romano Lisansüstü Eğitim Bursu AJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
