Summary
وهذا الفيديو لشرح كيفية الحصول على hemocytes (خلايا الدم) من الحبار قصير الذيل في هاواي ،
Abstract
الدراسات المتعلقة بدور جهاز المناعة في التوسط بين الإشارات الجزيئية البكتيريا النافعة ومضيفيهم ، في السنوات الأخيرة ، وقدمت مساهمات كبيرة لفهمنا لتطور المشترك للحقيقيات النوى مع مجهريات البقعة بهم. لعلاقة تكافلية بين الحبار قصير الذيل في هاواي ،
Protocol
- إعداد 500 مليليتر من 0.22 تعقيم مياه البحر فلتر ميكرون الاصطناعي (FSW ؛ ملوحة 35 جزء في الألف). تصفية مياه البحر مصطنعة أو طبيعية من خلال مرشح 0.22 ميكرون ميكرون لإزالة الجزيئات والبكتيريا.
- تخدير شخص بالغ واحد قصير الذيل هاواي الحبار (Euprymna scolopes) عبر وضعها في حل 2 ٪ من الايثانول في FSW. وضع الحيوانات في التخدير لمدة 10 دقائق تقريبا. سوف تتوقف السباحة والحبار لن تستجيب بنشاط للمس. لا يزال ينبغي استمرار التنفس ، وأشار من قبل الحركة من عباءة ، والنشاط حامل الصباغ يتعين مراعاتها.
- مكان الحبار مع الجانب البطني مواجهة على صينية الشمع تشريح القياسية. يغرق هذا الحيوان مع FSW تحتوي على 2 ٪ من الإيثانول.
- باستخدام معيار واحد 200 نصائح ميكرولتر ماصة ، والتراجع القمع وعباءة لفضح الاوعية الدموية الرئيسية رأسي تقع بين العينين اثنين.
- المحاقن المعقمة باستخدام مل 1 بنسبة 26.5 عيار الإبرة ، وثقب السفينة وسحب الدم رأسي بين 50-100 ميكرولتر من الدملمف. ضع الدملمف في أنبوب 1.5 مل العقيمة على الجليد.
ملاحظة : إذا كان الحيوان سيكون بمثابة المانحة مرات متعددة ، والانسحاب فقط 10-20 ميكرولتر من الدملمف في أي وقت من الأوقات. عودة الحيوان إلى خزان مياه البحر العادية. سوف الحيوان احياء في غضون 30 دقيقة. - تغسل hemocytes جمعت حديثا وإعادة علقت في 500 ميكرولتر من محلول رينغر الحبار ق (S - قارعو الأجراس ؛ كلوريد الصوديوم 530 ملم ، 10 ملم بوكل ، 25 مم MgCl 2 و 10 ملي CaCl 2 و 10 ملي HEPES العازلة ، ودرجة الحموضة 7.5).
- ويتم تحديد تركيزات كرية دموية التي عدادة الكريات ، ويتم إضافة حوالي 2000 الخلايا إلى زلات غرف الغطاء الزجاجي ، وسمح للانضمام إلى الزجاج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الكثافة ، وتشكيل hemocytes المونولاير موحدة على زجاج سطح الشريحة.
- الجرثومي لمراقبة ملزمة لhemocytes المضيفة ، ويتعرض لhemocytes سلالة بكتيرية fluorescently المسمى مثل fischeri الضمة ES114 و / أو الضمة harveyi B392 ، يحتوي كل منها على مراسل الخضراء الفلورسنت. V. fischeri ES114 والخامس تزرع harveyi B392 إلى منتصف مرحلة تسجيل في وسائل الاعلام المياه تريبتون البحر (سبحانه وتعالى) في 28 درجة مئوية في شاكر المداري. يتم قياس الكثافة البصرية في spectrophotometrically ل 600Nm لتحديد كثافة الخلية. البكتيريا هي مكعبات بواسطة الطرد المركزي (5000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق) ، يتم تجاهل طاف ، وبيليه هو إعادة معلقة في S - قارعو الأجراس.
- تضاف 100000 الخلايا البكتيرية إلى كل من المجلسين بحيث جيدا أن هناك 50 في كرية دموية البكتيريا في المتوسط. والمحتضنة للكرية دموية / البكتيريا في حل مخاليط رينغر S - s في 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، وتحدد وقتا لتحقق أقصى مستوى من الربط.
- ثم يتم السيتوبلازم من hemocytes ملطخة fluorescently مع أورانج CellTracker 0.005 ٪ (Invitrogen) ثم غسلها في S - قارعو الأجراس لتصور الخلايا.
- وينظر hemocytes ملطخة البكتيريا يرتبط بها من مضان باستخدام إما المجسام زايس V20 ديسكفري الفلورسنت أو SP2 لايكا المجهر الطيفي ليزر متحد البؤر ، وعددت على كامل سطح الخلية الحيوانية.
ممثل النتائج
لأن رأسيات الأرجل الدملمف يحتوي هيموسيانين خارج الخلية وليس الهيموغلوبين ، بناء على الأوكسجين ، فإن الدملمف بدوره الأزرق الداكن. وسيتم الحصول على ما معدله 5000 hemocytes ~ لكل ميكرولتر من الدملمف باستخدام هذا الأسلوب. بعد الانضمام إلى زلات تغطية غرف وتلطيخ الفلورسنت ، وينبغي أن تظهر hemocytes الحمراء الزاهية وfluorescently amoeboid في الشكل. لالتصاق البكتيريا ، V. وسوف تلتزم fischeri سيئة للhemocytes (1-2 الخلايا البكتيرية في خلايا الدم) ، في حين V. وسوف تلتزم بشدة harveyi (10-15 الخلايا البكتيرية في كرية دموية).
الشكل 1. الكبار هاواي قصير الذيل الحبار Euprymna scolopes عرض موقف الاوعية الدموية الرأسية.
الشكل 2. النتائج من التعرض لكرية دموية fischeri الضمة (A) والضمة harveyi (B). أحمر ، برتقالي المقتفي الخلية ؛ الخضراء GFP المسمى البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الدراسات المتعلقة بدور جهاز المناعة في التوسط بين الإشارات الجزيئية البكتيريا النافعة ومضيفيهم ، في السنوات الأخيرة ، وقدمت مساهمات كبيرة لفهمنا لتطور المشترك للحقيقيات النوى مع مجهريات البقعة بهم. وقد أثبت نظام الحبار / ضمة نفسها كنظام نموذج الانقياد للإجابة على الأسئلة الأساسية في هذا المجال 2،3،5،6،8. في ضوء جهاز من أجهزة scolopes Euprymna الحبار تصاريح الاستعمار حصرا من قبل fischeri بكتيريا مضيئة. لأن الأنسجة التي منزل البكتيريا البقاء على اتصال مع مياه البحر ، يجب أن لا الحبار تعزيز التكافل محددة فقط ولكن أيضا أن يواصل استبعاد البكتيريا الأخرى. وقد كشفت الدراسات ان استمرار مثل بلعم hemocytes المرجح لعب دورا هاما في إنشاء وصيانة هذه الرابطة 1،4،7. لأن المضيف الحبار يفتقر إلى الحصانة على التكيف ، وخصوصية مدهشة وجدت في هذه الجمعية يجب أن يكون كليا أو جزئيا بوساطة من خلال نظام المناعة الفطرية. وكشفت التحقيقات الأخيرة من هذه الخلايا الدموية التي hemocytes المعزولة من E. وتعترف scolopes يبلعم V. fischeri والبكتيريا التكافلية تفاضلي غير أن الاستعمار ويؤدي على الأرجح إلى نوع من "التسامح المناعي" من المتكافلة 4. وهذا البروتوكول لشرح كيفية الحصول على هذه الخلايا في الدم بنجاح من الحبار الكبار واختبار قدرتها على ربط البكتيريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
مصادر التمويل : جامعة كونيتيكت مؤسسة البحوث وقسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية لSVN ، سيغما شى غرانت في والمعونة من البحوث وH. R. انطونيو وMajorie
رومانو زمالة دراسات عليا التعليم لAJC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
