Summary
इस वीडियो में प्रदर्शन करेंगे कैसे प्राप्त करने के लिए हवाई कट दुम विद्रूप से hemocytes (रक्त कोशिकाओं),
Abstract
फायदेमंद बैक्टीरिया और उनके मेजबान के बीच आणविक संकेत mediating में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका के विषय में अध्ययन, हाल के वर्षों में है, उनके microbiota के साथ eukaryotes के सह विकास की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया. हवाई कट दुम व्यंग्य के बीच सहजीवी संघ,
Protocol
- 500 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर निष्फल कृत्रिम समुद्री जल के MLS (35 लवणता ppt FSW) तैयार करें. फ़िल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से कृत्रिम या प्राकृतिक समुद्री जल कणों और बैक्टीरिया को दूर करने के लिए.
- FSW में इथेनॉल के 2% समाधान में रखकर एक वयस्क हवाई कट दुम व्यंग्य (Euprymna scolopes) anesthetize. जानवर संवेदनाहारी में लगभग 10 मिनट के लिए रखें. विद्रूप तैराकी संघर्ष और स्पर्श जवाब नहीं होगा सक्रिय. जारी श्वसन, पोशिश के आंदोलन ने संकेत दिया है, और chromatophore गतिविधि अभी भी मनाया जाना चाहिए.
- उदर एक मानक मोम विच्छेदन ट्रे पर का सामना करना पड़ पक्ष के साथ व्यंग्य रखें. डूब FSW 2% इथेनॉल युक्त के साथ पशु.
- एक मानक 200 μl विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग, कीप और दो आँखों के बीच स्थित मुख्य मस्तक का रक्त वाहिका का पर्दाफाश करने के लिए पोशिश वापस खींच.
- 26.5 गेज सुई, रक्त वाहिका मस्तक का पंचर और hemolymph के 50-100 μl बीच वापस लेने के साथ एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करना. बर्फ पर एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में hemolymph रखें.
नोट: यदि एक जानवर एक दाता कई बार के रूप में काम करेंगे, केवल किसी भी समय पर hemolymph के 10-20 μl वापस ले. एक सामान्य समुद्री जल के टैंक करने के लिए पशु लौटें. 30 मिनट के भीतर जानवर को पुनर्जीवित करेंगे. - हौसले से एकत्र hemocytes धोया और व्यंग्य घंटी समाधान (एस Ringers, 530 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl, 25 MgCl 2 मिमी, 10 मिमी CaCl 2 और 10 मिमी HEPES बफर, 7.5 पीएच) के 500 μl में फिर से निलंबित कर दिया.
- Hemocyte सांद्रता hemocytometer द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, और लगभग 2,000 कोशिकाओं संभाग कांच कवर फिसल जाता है के लिए जोड़ रहे हैं, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कांच का पालन की अनुमति दी. इस घनत्व में, hemocytes गिलास स्लाइड सतह पर वर्दी monolayer के रूप में.
- मेजबान hemocytes के लिए बाध्य जीवाणु निरीक्षण करने के लिए, hemocytes fluorescently लेबल विब्रियो fischeri ES114 और / या विब्रियो B392 harveyi, प्रत्येक एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट संवाददाता युक्त जैसे बैक्टीरियल तनाव को उजागर कर रहे हैं. वी. fischeri ES114 और वी. harveyi B392 28 पर मध्य लॉग चरण में एक समुद्र के पानी tryptone मीडिया (SWT) ° सी एक कक्षीय प्रकार के बरतन में बड़े हो रहे हैं. 600nm पर ऑप्टिकल घनत्व मापा spectrophotometrically है सेल घनत्व निर्धारण. बैक्टीरिया centrifugation (5 मिनट के लिए 5000 rpm) द्वारा pelleted हैं, सतह पर तैरनेवाला त्याग है, और गोली एस Ringers में फिर से निलंबित कर दिया.
- 100,000 बैक्टीरियल कोशिकाओं प्रत्येक कक्ष के लिए जोड़ रहे हैं अच्छी तरह से इतना है कि औसत पर hemocyte 50 प्रतिशत बैक्टीरिया होते हैं. hemocyte बैक्टीरिया / मिश्रण के 25 में एस घंटी समाधान ° सी 1 ज के लिए, एक बंधन के अधिकतम स्तर उपज के लिए निर्धारित समय में incubated हैं.
- hemocytes के cytoplasm तो fluorescently 0.005% CellTracker औरैंज (Invitrogen) के साथ दाग और फिर कोशिकाओं कल्पना एस Ringers में धोया.
- जुड़े बैक्टीरिया से सना हुआ hemocytes प्रतिदीप्ति द्वारा देखा जाता है या तो एक Zeiss डिस्कवरी V20 फ्लोरोसेंट त्रिविमेक्ष या एक Leica SP2 के वर्णक्रमीय लेजर confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग, और जानवर सेल की पूरी सतह पर प्रगणित.
प्रतिनिधि परिणाम
क्योंकि cephalopod hemolymph कोशिकी hemocyanin और oxygenation पर, नहीं हीमोग्लोबिन होते हैं, hemolymph गहरे नीले रंग बदल जाएगा. ~ 5000 hemocytes hemolymph के μl प्रति एक औसत इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त किया जाएगा. संभाग कवर फिसल जाता है और फ्लोरोसेंट धुंधला के पालन के बाद, hemocytes चमकीले fluorescently लाल और आकार में amoeboid प्रकट करना चाहिए. बैक्टीरियल आसंजन, वी. के लिए fischeri खराब hemocytes का पालन (रक्त कोशिका प्रति 1-2 बैक्टीरियल कोशिकाओं) वी. जबकि दृढ़ता से पालन harveyi (hemocyte प्रति 10-15 बैक्टीरियल कोशिकाओं).
चित्रा 1 प्रौढ़ हवाई कट दुम विद्रूप Euprymna मस्तक का रक्त वाहिनियों की स्थिति दिखा scolopes है .
चित्रा 2 विब्रियो fischeri (ए) और विब्रियो harveyi (बी) के लिए hemocyte जोखिम के परिणाम हैं. लाल, सेल ट्रैकर ऑरेंज, ग्रीन, GFP लेबल बैक्टीरिया.
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Discussion
फायदेमंद बैक्टीरिया और उनके मेजबान के बीच आणविक संकेत mediating में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका के विषय में अध्ययन, हाल के वर्षों में है, उनके microbiota के साथ eukaryotes के सह विकास की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण योगदान दिया. व्यंग्य / विव्रियो प्रणाली ही एक विनयशील मॉडल प्रणाली के लिए इस क्षेत्र में 2,3,5,6,8 मौलिक सवालों के जवाब के रूप में साबित हो गया है. विद्रूप Euprymna scolopes के प्रकाश अंग उपनिवेशण विशेष रूप से परमिट चमकदार जीवाणु विब्रियो fischeri द्वारा. क्योंकि घर कि ऊतकों बैक्टीरिया समुद्री जल के साथ संपर्क में रहते हैं, विद्रूप केवल विशिष्ट सहजीवन नहीं पालक, लेकिन यह भी अन्य जीवाणुओं को बाहर करने के लिए जारी करना चाहिए. जारी अध्ययन से पता चला है कि बृहतभक्षककोशिका तरह hemocytes की संभावना इस 1,4,7 संघ की स्थापना और रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. क्योंकि विद्रूप मेजबान प्रतिरक्षा अनुकूली, अद्भुत इस संघ में पाया विशिष्टता पूरी या आंशिक रूप से मध्यस्थता सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के माध्यम से किया जाना चाहिए का अभाव है. इन रक्त कोशिकाओं की हाल ही में एक जांच से पता चला कि hemocytes ई. से अलग scolopes पहचान और phagocytose वी. fischeri और गैर सहजीवी जीवाणु विभिन्न प्रकार और कि उपनिवेशन की संभावना 4 symbionts के प्रतिरक्षा सहनशीलता "का एक प्रकार की ओर जाता है है. इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कैसे सफलतापूर्वक वयस्क विद्रूप से इन रक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए और उनके लिए बैक्टीरिया को बाध्य करने की क्षमता का परीक्षण होगा.
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Acknowledgments
अनुदान स्रोत: विश्वविद्यालय कनेक्टिकट रिसर्च फाउंडेशन और आण्विक और सेल बायोलॉजी के विभाग के SVN, सिग्मा ग्यारहवीं अनुदान सहायता के अनुसंधान और एंटोनियो एच. और Majorie आर.
रोमानो स्नातक शिक्षा AJC फैलोशिप
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
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