Summary
Это видео будет показано, как получить гемоциты (клетки крови) из Гавайского бобтейл кальмары,
Abstract
Исследования о роли иммунной системы в посредничестве молекулярной сигнализации между полезными бактериями и их хозяева, в последние годы, внесли существенный вклад в наше понимание совместной эволюции эукариот с их микрофлоры. Симбиотические ассоциации между Гавайских бобтейл кальмары,
Protocol
- Подготовка 500 мл 0,22 мкм фильтр-стерилизовать искусственной морской воде (FSW, соленость 35 п.п.). Фильтры искусственные или естественные морской воды через 0,22 мкм микронный фильтр для удаления частиц и бактерий.
- Обезболить одного взрослого Гавайских бобтейл кальмаров (Euprymna scolopes), поместив в 2% раствор этанола в FSW. Место животное в анестетик в течение примерно 10 минут. Кальмар перестанет плавания и не будет активно реагировать на прикосновения. Продолжение дыхания, указывает движение мантии, и хроматофора деятельности все равно должны быть соблюдены.
- Место кальмаров с вентральной стороной вверх на стандартный лоток рассечение воска. Погрузите животное с ЖСБ, содержащего 2% этанола.
- Используя один стандартный 200 мкл наконечники для пипеток, отступить воронку и мантии, чтобы разоблачить основных головных кровеносных сосудов расположены между двумя глазами.
- Используя стерильный шприц 1 мл с 26,5-иглы, прокол головных кровеносных сосудов и вывести между 50-100 мкл гемолимфы. Место гемолимфы в стерильные 1,5 мл пробирку на льду.
Примечание: Если животное будет служить в качестве донора несколько раз, только снять 10-20 мкл гемолимфы в любой момент времени. Вернуться животных к нормальному танк морской водой. Животное возродится в течение 30 мин. - Только что собранные гемоциты промывают и ресуспендировали в 500 мкл раствора Рингера Squid с (S-Ringers; 530 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 25 мМ MgCl 2, 10 мМ CaCl 2 и 10 мМ буфера HEPES, рН 7,5).
- Гемоцитов концентрации определяются гемоцитометра, и примерно 2000 клетки добавляются в патрон скользит стеклянной крышкой, и позволило придерживаться стекла в течение 10 мин при комнатной температуре. На этом плотность, гемоциты образуют единую монослоя на поверхности предметное стекло.
- Для наблюдения бактериальных обязательными для размещения гемоциты, гемоциты подвергаются флуоресцентно меченных бактериального штамма, таких как Vibrio ПзсЬеп ES114 и / или Vibrio harveyi B392, каждый из которых содержит зеленый флуоресцентный репортер. V. ПзсЬеп ES114 и В. harveyi B392 выращивают до середины логарифмической фазы в морской воде триптон СМИ (SWT) при 28 ° С на орбитальном шейкере. Оптическую плотность при 600 нм измеряется спектрофотометрически, чтобы определить плотность клеток. Бактерии центрифугированием (5000 оборотов в минуту в течение 5 мин), супернатант отбрасывается, и осадок ресуспендировали в S-Ringers.
- 100000 бактериальные клетки добавляются в каждой камере также чтобы Есть 50 бактерий на гемоцитов в среднем. Гемоцитов / бактерий смеси инкубируют в растворе S-звонка с при 25 ° С в течение 1 ч, время определяется для получения максимального уровня связывания.
- Цитоплазме гемоциты затем флуоресцентно окрашенных 0,005% CellTracker Orange (Invitrogen), а затем промывают в S-Ringers для визуализации клеток.
- Витражи гемоциты с соответствующими бактериями рассматриваются флуоресценции с использованием либо Zeiss Discovery V20 флуоресцентные стереоскоп или Leica SP2 спектральных лазерной конфокальной микроскопии, и перечислил на всей поверхности клеток животных.
Представитель Результаты
Из головоногих гемолимфы содержит внеклеточная гемоцианин и не гемоглобин, при оксигенации, гемолимфы станет темно-синий. Среднем ~ 5000 гемоциты в мкл гемолимфы будут получены с помощью этого метода. После присоединения к крышке патрон скользит и флуоресцентной окраски, гемоциты должна появиться ярко красный и флуоресцентно амебоидных в форме. Для бактериальной адгезии, В. ПзсЬеп будет придерживаться плохо поддается гемоциты (1-2 бактериальных клеток в клетки крови), а В. harveyi будет придерживаться сильно (10-15 бактериальных клеток на гемоцитов).
Рисунок 1. Взрослый Гавайских бобтейл кальмара Euprymna scolopes показывает позицию головных кровеносных сосудов.
Рисунок 2. Результаты гемоцитов воздействия Vibrio ПзсЬеп (А) и Vibrio harveyi (B). Красный, оранжевый сотовый Tracker, зеленый, GFP-меченых бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования о роли иммунной системы в посредничестве молекулярной сигнализации между полезными бактериями и их хозяева, в последние годы, внесли существенный вклад в наше понимание совместной эволюции эукариот с их микрофлоры. Кальмар / вибриона система зарекомендовала себя как послушный модели системы ответить на фундаментальные вопросы в этой области 2,3,5,6,8. Световых органом кальмара Euprymna scolopes позволяет колонизации исключительно светящейся бактерии Vibrio ПзсЬеп. Потому что ткани, которые дома бактерии остаются в контакте с морской водой, кальмары, должны не только способствовать конкретным симбиоз, но и продолжить, чтобы исключить другие бактерии. Продолжение исследования показали, что макрофагами, как гемоциты вероятно, играют важную роль в установлении и поддержании этого объединения 1,4,7. Потому что хозяин кальмар хватает адаптивного иммунитета, удивительная специфика найти в этой ассоциации должно быть полностью или частично опосредуется через врожденную иммунную систему. Последние исследования этих клеток крови показал, что гемоциты изолированы от E. scolopes признать и фагоцитируют В. ПзсЬеп и не симбиотических бактерий и дифференциальной, что колонизация вероятно, приводит к своего рода «иммунной толерантности» симбионтов 4. Этот протокол будет показано, как успешно получить эти клетки крови от взрослых кальмаров и проверить свои способности связывать бактерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Источники финансирования: Университет штата Коннектикут Фонд исследований и Отдел молекулярной и клеточной биологии в SVN, Sigma Xi Грант-в-помощь-исследований и Антонио Х. и Р. Majorie
Романо последипломного образования стипендия в АЕК
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek chambered #1.0 borosilicate coverglass system (8-chambers) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml latex-free insulin syringe | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
